1、 DB41 河南省 地 方 标 准 DB 41/T 708 2011 规模牛场口蹄疫监测技术规范 2011 - 12 - 20 发布 2011 - 12 - 20 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 708 2011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局 提出并归口。 本标准由河南省动物疫病预防控制中心负责起草，中国动物疫病预防控制中心参加起草。 本标准主要起草人： 张志凌、王功民、吴志明 、张健、闫若潜、方先珍、谢彩华。 DB41/T 708 2011 1 规模牛场口蹄疫监测技术规范 1 范围 本标准规定了规模牛场口蹄疫监测样
2、品 的采集和保存、监测方法和方式、监测结果的处理。 本标准适用于规模牛场口蹄疫 监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18935 2003 口蹄疫诊断技术 中华人民共和国农业部 口蹄疫防治技术规范 中华人民共和国农业部公告第 503号 高致病性动物病原微生物菌( 毒 )种或者样本运输包装规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酶联免疫吸附试验（ ELISA） 一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原 (或抗
3、体) 。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。 4 样品的 采集和保存 要求 4.1 样品的 采集和保存 4.1.1 组织样品 4.1.1.1 样品的选择 用于病毒分离、鉴定的样品应选择牛未破裂的舌面或蹄部、鼻镜、乳头等部位的水疱皮和水疱液。对临床健康但怀疑带毒的牛可在扑杀后采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品作为检测材料。 4.1.1.2 样品的 采集 和 保存 4.1.1.2.1 水疱 样品采集部位可用清水清洗，不 应 使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭。 DB41/T 70
4、8 2011 2 4.1.1.2.2 未破裂 水疱 中的 水疱 液 用灭菌注射器采集不少于 1mL，装入灭菌小瓶中 ， 加抗菌素（青霉素终浓度为 10 000 IUmL-1,链霉素终浓度为 10 mgmL-1） ， 加盖密封并用胶带封口 ， 及时 冷冻保存。 4.1.1.2.3 剪取新鲜水疱皮 3g 5g放入灭菌小瓶中 ， 加 2倍体积的 50甘油 /磷酸盐缓冲液 (pH7.4), 加盖密封 并用胶带封口 ， 冷冻保存。 4.1.1.2.4 在无法采集 水疱液和 水疱皮时， 应 采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品 3 g 5 g 装入灭菌的小瓶内 , 加盖密封 并用胶带封口 ， 冷冻保存。 4.
5、1.1.2.5 每份样品的包装瓶上均要贴上防水标签，并写明采集地点、样品编号、动物种类、时间等。 4.1.2 牛 食道 -咽部分泌物 (O-P 液 )样品 4.1.2.1 样品 的 采集 4.1.2.1.1 被检动物应 在采样前禁食 (可饮水)12h ，以免反刍胃内容物严重污染 O-P 液。 4.1.2.1.2 采样探杯在使用前经 0.2柠檬酸 或 2氢氧化钠 溶液 浸泡 5 min，再用蒸馏水 反复 冲洗 3次 以上 。每采完一头牛 ,探杯 应重复进行消毒和清洗。 4.1.2.1.3 采样时动物站立保定，将探杯随动物吞咽动作送入其食道上部 10cm 15cm处，轻轻来回移动 23 次，然后将
6、探杯拉出。如采集的 O-P 液被反刍胃内容物严重污染， 应 用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。 4.1.2.2 样品 的 保存 将 采集到 的 8 mL 10 mL O-P 液倒入 大于 25 mL的灭菌玻璃容器中 , 容器中应事先加有 8mL10mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液（ 0.04 molL-1 、 pH7.4），加盖密封后充分 摇匀，贴上防水标签 ，并写明采集地点、 样品 编号、动物种类、时间等 ，及时 放入 冷藏 箱内， 12 h 内 转往 -15以下冰箱冻存 。 4.1.3 血清采集 牛群发生疑似疫情而错过组织样品采集时机时，应 无菌操作采集动物血液，每头不少于 10mL。自然
7、凝固后无菌分离血清装入灭菌小瓶中，加适量抗菌素 （ 青霉素终浓度为 10 000 IUmL-1， 链霉素终浓度为 10 mgmL-1） ，加盖密封后 2 8 冷藏保存。 每份样品的包装瓶上应贴上防水标签，并写明采集地点、样品编号、动物种类、时间等。通过抗体检测，做出追溯性诊断。 4.2 样品登记 采集样品后应及时填写样品采集登记表 ，一式 3 份 （参见附录 A）。 4.3 样品的运送 4.3.1 将采集好的样品 装入金属套筒中，套筒应填充防震材料，加盖密封，与采样记录一同装入专用运输容器中。专用运输容器应隔热坚固，内装适当冷冻剂和防震材料。 4.3.2 外包装上应 加贴生物 危险 警示标 识
8、及警告语， 并符合 高致病性动物病原微生物菌 (毒 )种或者样本运输包装规范 要求。样品应于 24h内运送到检测单位。 4.3.3 送检材料应 附有 符合 4.2样品 采集 登记表 。 DB41/T 708 2011 3 5 监测方法 与方式 5.1 血清学监测 O 型口蹄疫 抗体检测 用正向间接血凝试验 （ IHA） 或液相阻断 酶联免疫吸附试验 （ ELISA） ， O 型合成肽疫苗免疫后抗体检测用相应的口蹄疫病毒 VP1 结构蛋白抗体间接 ELISA； 亚洲 型 和 A 型 口蹄疫 抗体检测 用液相阻断 ELISA。 具体 试验方法 按照 口蹄疫防治技术规范 操作 。 5.2 病原学监测
9、 采用 RT-PCR 方法直接检测病原。具体 按照 GB/T 18935 2003 操作 。 5.3 疫情监视与报告 县级以上动物 防疫监督机构应每月按 5.1、 5.2的方法开展一次 口蹄疫 疫情普查。牛场怀疑发生 口蹄疫 时，应 立即报告当地 动物防疫监督机构 ， 并采集样品送省级动物防疫监督机构检测，必要时送国家口蹄疫参考实验室 确诊 。 5.4 免疫效果监测结果判定 5.4.1 O 型正向间接血凝抑制试验的抗体效价 25为合格。 5.4.2 亚洲 I型 、 A 型 液相阻断 ELISA 的抗体效价 26为合格。 5.4.3 存栏牛群免疫 抗体合格率 70%判定合格。 5.5 监测要求
10、5.5.1 监测对象 包括不同年龄 /品种的牛 。 5.5.2 样品采集及检测 5.5.2.1 免疫效果监测采集牛的血清 ，检测方法参照 5.1。 5.5.2.2 病原学监测采集牛的血清、 O-P 液和组织样品等 ，检测方法参照 5.2。 5.5.3 抽样方法及数量 5.5.3.1 抽样方法：依照牛存栏数量采取层次分类随机选样法抽样。 5.5.3.2 抽样数量： 被检牛群的 10%。 6 监测结果处理 6.1 存栏牛群免疫抗体合格率 70%，牛群应立即加强免疫一次。 6.2 病原学监测有疑似阳性样品 存在 ，应立即报告当地动物疫病预防控制机构，并送样至国家口蹄疫参考实验室确诊。 DB41/T
11、708 2011 4 6.3 免疫效果监测和病原学监测结果 每月应向 当地动物疫病预防控制机构报告一次 ， 规模牛场对监测结果应 存档或备案。 DB41/T 708 2011 5 附 录 A （资料性附录） 样品采集登记 A.1 样品采集登记表 样品采集登记表参见表 A.1。 表 A.1 样品采集登记表 采样日期： 编号： 场 /户 /养殖小区名称 采样地点 省（市） 市 (地、州 ) 县 (市、区 ) 镇 (乡 ) 场 /村 联系人 联系电话 被采样牛类别 日龄 存栏量 样品名称 样品数量 样品编号 被采样牛 临床健康状况 DB41/T 708 2011 6 表 A.1（续） 被采样牛 免疫情况 免疫 病种 疫苗类型 疫苗厂家 疫苗批号 免疫 次数 免疫 剂量 末次免疫时间 /末次免疫至采样的间隔天数 被采样单位盖章（签名） 年 月 日 采样单位盖章（采样人签名） 年 月 日 备注 A.2 说明 A.2.1 样品名称指全血、血清、抗凝血、棉拭子、心脏、肺脏、气管、脑等脏器组织。 A.2.2 疫苗类型中应注明所用疫苗 的 具体型（ O型、 A型、亚洲 型）、疫苗种类（单联疫苗或多联疫苗，灭活疫苗或合成肽疫苗）等信息。 A.2.3 此单一式三份，第一联由采样单位保 存、第二联随样品、第三联由被采样单位保存 。
