1、ICS 67.040 C 53 B 中华人民共和国国家标准GB/T 5009. 35-2003 代替GB/T5009. 35一1996食品中合成着色剂的测定Determination of synthetic colour in foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生费发布中国国家标准化管理委员会GB/T 5009.35-2003 前言本标准代替GB/T5009.35-1996(食品中合成着色剂的测定方法。本标准与GB/T5009. 35-1996相比主要修改如下s修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中合成着色剂的测定h按照GB/T20001. 4
2、-2001(标准编写规则第4部分2化学分析方法对原标准的结构进行了修改g增加了示波极谱法作为第三法。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第一法由天津市食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、宁夏回族自治区卫生防疫站、西安市卫生防疫站负责起草。276 本标准第二法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准第二法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订。GB/T 5009.35-2003 食品中合成着色荆的测定1 范围本标准规定了食品中合成着色剂的测定方法。本标准适用于食品中合成着色剂的测定。本方法检出限z新红5ng、
3、拧橡黄4ng、克莱红6ng、捆脂红8ng、日落黄7ng、赤薛红18ng、亮蓝26吨，当进样量相当0.025g时，检出浓度分别为0.2mg/kg;O. 16 mg/kg, O. 24 mg/kg;O. 32 mg/kg; 0.28 mg/kg;O. 72 mg/kg, 1. 04 mg/kg o 第一法高效液相色谱法2 原理食品中人工合成着色剂用聚酷胶吸附法或液液分配法提取，制成水溶液，注人高效液相色谱仪，经反相包i普分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量.3试J3.1 正己烧。3.2 盐酸。3.3 乙酸。3.4 甲醇z经0.5m滤膜过滤。3.5 聚酷胶粉(尼龙6):过200目筛。3.6
4、乙酸钱溶液(0.02mol/L)称取1.54 g乙酸钱，加水至1000mL，溶解，经0.45m滤膜过滤。3. 7 氨水z量取氨水2mL，加水至100mL，混匀。3.8 氨水一乙酸镀溶液(0.02 mol/L):量取氨水0.5mL，加乙酸镀溶液(0.02mol/L)至1000 mL. 混匀。3.9 甲醇甲酸(6+4)溶液量取甲醇60mL，甲酸40mL.混匀。3.10 拧橡酸溶液z称取20g拧橡酸(CeH, O, H20)，加水至100mL，溶解混匀。3.11 无水乙醇-氨水水(7+2+1)溶液z量取无水乙醇70mL、氨水20mL、7:.10 mL，混匀。3.12 三正辛胶正丁醇溶液(5%):量取
5、乏正辛胶5mL，:flO正丁醇至100mL，混匀。3.13 饱和硫酸纳溶液。3.14 硫酸锅溶液(2g/L)。3.15 pH6的水:7:.加拧橡酸溶液调pH值到603.16 合成着色剂标准溶液z准确称取按其纯度折算为100%质量的拧橡黄、日落黄、克莱红、朋脂红、新红、赤薛红、亮蓝、能蓝各O.100 g，置100mL容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶液(1.00 mg/mU。3.17 合成着色剂标准使用液:1陷用时上述溶液(或将3.16)加水稀释20倍，经0.45m滤膜过滤，配成每毫升相当于50.0吨的合成着色剂。4 仪器高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。277 GB(T切09.3
6、5-20035 分析步骤5.1 试样处理5. 1. 1 桔子汁、果味水、果子露汽水等z称取20.0 g40. 0 g，放入100mL烧杯中，含二氧化碳试样加热驱除二氧化碳。5. 1. 2 配制酒类:称取20.0 g40. 0 g，放100mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。5. 1. 3 硬糖、蜜钱类、淀粉软糖等=称取5.00 g10. 00 g粉碎试样，放入100mL小烧杯中，加水30 mL.温热溶解，若试样溶液pH值较高，用拧橡酸溶液调pH值到6左右。5. 1. 4 巧克力豆及着色糖衣制品z称取5.00 g10. 00 g，放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到试样无色素为止，
7、合并色素漂洗液为试样溶液。5.2 色素提取5.2.1 聚llJl:胶吸附法试样溶液加拧棕酸溶液调p日值至o6，加热至60C，将1g聚酸胶粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60CpH=4的水洗涤3次5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3次5次(含赤薛红的试样用5.2.2法处理)，再用水洗至中性，用乙酶-氨水水混合溶液解吸3次5次，每次5mL.收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经0.45m滤膜过滤，取10L进高效液相色谱仪。5.2.2 液液分配法(适用于含赤葬红的试样):将帘l备好的试样溶液放入分液漏斗中，如2mL盐酸、三正辛胶正丁醇溶液(
8、5%)10mL20 mL.振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸销溶液洗2次，每次10mL.分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL.转移至分液漏斗中，加60mL正己烧，混匀，加氨水提取2次3次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烧洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL.经滤膜。.45m过滤，取10L进高效液相色谱仪。5.3 离效液栩色i蕾参考条件5.3.1 柱:YWG-C18 10m不锈钢柱4.6mm(i. d) X 250 mm. 5.3.2 流动相3甲醇2乙酸镀溶液(pH=4,0.02 mo/L)。5.3.
9、3 梯度洗脱g甲醇:20%35%，3%/min，35%98% ，9%/min，98%继续6mino 5.3.4 流速:1mL/min. 5.3.5 紫外检测器，254nm波长。5.4 测定取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。5.5 结果计算试样中着色剂的含量按式(1)进行汁算。x= A X 1000 m X V,jV, X 1 000 X 1 000 . ( 1 ) 式中=X 试样中着色剂的含量，单位为克每千克(g/kg); A一一样液中着色剂的质量，单位为微克仰自l;V，一一一进样体积，单位为毫升(mL);V，一一试样稀释总体积，单
10、位为毫升(mL)，m 试样质量，单位为克(g)。计算结果保留两位有效数字。278 GB/T 5009.35-2003 5.6 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5.7 其他1 新红$2一一拧橡黄$3一-克莱红$4一艇蓝s5 脑脂红，6 日落黄$7 亮蓝;8 赤薛红。6 原理图1八种着色JllJ色谱分离图第二法薄层色谱法水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酿胶吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。最低检出量为50g，点样量为1L时，检出浓度约为50mg/kg, 7 试剂7.1 石油酷z沸程60C90C。
11、7.2 甲醇。7.3 聚酷胶粉(尼龙6)，200日。7.4 硅胶G。7.5硫酸，0+10)。7.6 甲醇甲酸溶液，(6十4)。7.7 氢氧化fl内溶液(50g/L)。7.8 海砂z先用盐酸(1十10)煮沸15min，用水洗至中性，再用氢氧化纳溶液(50g/L)煮沸15min，用水洗至中俭，再于105C干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。7.9 乙醇(50%)。7.10 乙醇氨溶液z取1mL氨水，加乙醇(70%)至100mL。279 GB/T 5009.35-2003 7.11 pH6的水.用拧稼酸溶液(20%)调节至pH6。7.12 盐酸(1十10)。7.13 拧攘酸溶液(200g/U。7.14
12、鸽酸纳溶液(100g/U。7.15 碎瓷片z处理方法同7.807.16 展开剂如下z7.16.1 正丁醇-元水乙醇氨水(1%)(6+2+3):供纸色谱用。7.16.2 正丁醇-毗脏-氨水0%)(6+3+4):供纸色谱用。7.16.3 甲乙圈丙酣-水(7+3+3):供纸色谱用。7.16.4 甲碎乙二胶氨水00+3+2):供薄层色谱用。7.16.5 甲醇-氨水乙醇(5+1十10):供薄层色谱用。7.16.6 拧橡酸销溶液(25g/L)氨水乙醇(8+1+2):供薄层色谱用。7.17 合成着色剂标准溶液z按3.16方法，分别配制着色剂的标准溶液浓度为每毫升相当于1.0 mg o 7.18 着色剂标准使
13、用液z临用时吸取色素标准溶液各5.0mL，分别置于50mL;容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0.10mg着色剂。8 仪器8.1 可见分光光度计。8.2 微量注射器或血色素吸管。8.3 展开槽，25cmX6 cmX4 cm o 8.4 层析缸。8.5 滤纸:中速滤纸，纸色谱用。8.6 薄层板:5cmX 20 cm。8.7 电吹风机。8.8 水泵。9 分析步骤9.1 试样处理9. 1. 1 果味水、果子露、汽水E称取50.0g试样于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳09. 1. 2 配制酒2称取100.0g试样于100mL烧杯中.加碎瓷片数块，加热驱除乙醇。9. 1. 3
14、 硬糖、蜜钱类、淀粉软糖2称取5.00g或10.0g盼碎的试样，加30mL水，温热溶解，若样液pH值较高，用拧橡酸溶液(200g/L)调至pH4左右。9. 1. 4 奶糖z称取10.0g粉碎均匀的试样，加30mL乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL，立即用硫酸溶液。十10)调至微酸性，再加1.0 mL硫酸。十10)，加1mL鸽酸纳溶液(100g/U ，使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。9. 1. 5 蛋糕类=称取10.0g粉碎均匀的试样，加海砂少许，混匀，用热风吹干用品(用于摸己干燥即可)，加入30mL石油隧搅拌。放置片刻，倾出石油酶，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，
15、全部倒入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下按9.1.4自置水浴上浓缩至约20mL起依法操作。9.2 吸附分离将处理后所得的溶液加热至70(;，加入O.5 g 1. 0 g聚酷胶粉充分搅拌，用拧橡酸溶液(200g/L) 调pH至4，使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酿胶粉。将吸附着色剂的聚酷胶全部转入G3垂融漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤)。用pH4的70(;水反复280 GB/T 5009.35-2003 洗涤，每次20mL.边洗边搅拌，若含有天然着色剂。再用甲醇甲酸溶液洗涤1次3次，每次20mL. 至洗液无色为止。
16、再用70C水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中应充分搅拌.然后用乙醉氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50m L. 用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至2mL后移入5mL容量瓶中，用50%乙醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。9.3 定性9.3.1 纸色谱取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3L10L试样溶液、1L2L着色剂标准溶液，挂于分别盛有7.16. 1、7.16. 2的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，
17、与标准斑比较定性。也可取0.5mL祥液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色剂标准溶液，依法展开，晾于后先定性后再供定量用。能蓝在碱性条件下易褪色，可用7.16.3展开剂。9.3.2 薄层色i曹9.3.2.1 薄层板的制备称取1.6 g聚酷胶粉、0.4g可溶性淀粉及2g硅胶G.置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温晾干后，于80C干燥1h.置干燥器中备用。9.3.2.2 点样离板底边2cm处将0.5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的左边点2L色素标准溶液。9.3.2.3 展开克莱红与脑脂红用7.16. 4展开剂，能班与亮蓝用7.16.
18、 5展开剂，拧橡黄与其他着色剂用7.16. 6 展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，掠干，与标准斑比较，如R，相同即为同一色素。9.4 定量9.4.1 试样测定将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移人漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，作比色用。9.4.2 标准曲线制备分别吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL脑脂红、宽莱红、拧橡黄、日落黄色素标
19、准使用溶液，或0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL亮蓝、能蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。上述试样与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(脑脂红510nm.宽莱红520 nm.拧橡黄430nm.日落黄482nm.亮蓝627nm.能蓝620nm).测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准系列日测比较。9.5 结果计算试样中着色剂的含量按式(2)进行计算。x = A X 1000 -m X V2 /Vj X 1 000 ( 2 ) 281 GB/T 5009.35-2003 式中zX一-试样中着色剂的含量，单位为克每千克(g/kg);
20、A 测定用样液中色素的质量，单位为毫克(mg);m 试样质量或体积，单位为克或毫升(g或mL);V j 试样解吸后总体积，单位为毫升(mL);V2 样液点板(纸)体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留两位有效数字。第三法示波极谱法10 原理食品中的合成着色剂，在特定的缓冲溶液中，在滴录电极上可产生敏感的极谱波，波高与着色剂的浓度成正比。当食品中存在一种或两种以上互不影响测定的着色剂时，可用其进行定性定量分析。11 试剂11. 1 底液A:磷酸盐缓冲液(常用于红色和黄色复合色素).可作克莱红、腼脂红、日落黄、拧橡黄以及自在蓝着色剂的测定底液。称取13.6g无水磷酸二氢伺(KH2PO.)和14.1
21、g元水磷酸氢二纳(Na2HPO.)或35.6g含结晶水的磷酸氢二销(Na2HPO.12H20l及10.0g氯化纳，加水溶解后稀释至1L11. 2 底液也乙酸盐缓冲液(常用于绿色和蓝色复合色素).可作能蓝、亮蓝、拧橡黄、日落黄着色剂的测定底液。量取40.0mL冰乙酸，加水约400mL.加入20.0g无水乙酸销，溶解后加水稀释至1L11. 3 拧橡酸溶液:200g/L。11. 4 乙醇氨溶液z取1mL浓氨水，加乙醇(70%)至100mL。11. 5 着色剂标准溶液z准确称取按其纯度折算为100%质量的人工合成着色剂。100g.溶解后置于100 mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液1mL含1.00 mg
22、着色剂。11. 6 着色剂标准使用溶液:吸取着色剂标准溶液1.00 mL.置于100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液1mL含10.0陪着色剂。12 仪器12.1 微机极谱仪。12.2 常用玻璃仪器。13 分析步骤13.1 试样处理13. 1. 1 饮料和酒类g取样10.0 mL25. 0 mL.加热驱除二氧化碳和乙醇，冷却后用200g/L氢氧化销和盐酸0+1)调至中性，然后加蒸馆水至原体积。13. 1. 2 表层色素类.取样5.0日1O.0 g.用蒸馆水反复漂洗直至色素完全被洗脱。合并洗脱液并定容至一定体积。13. 1. 3 水果糖和果冻类:取样5.0g.用水加热溶解，冷却后定容至25.0mL
23、, 13. 1. 4 奶油类:取样5.0g于50mL离心管中，用石油隧洗涤三次，每次约20mL30 mL.用玻璃棒搅匀，离心，弃上清液。低温挥去残留的石油隧后用乙醇氨溶液溶解并定容至25.0mL，离心，取上清液一定量水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗人10mL容量瓶并定容。282 GB/T 5009.35-2003 13. 1. 5 奶糖类取样5.0g溶于乙醇氨溶液至25.0mL，离心。取上清液20.0mL，加水20mL，加热挥去约20mL，冷却，用200g/L拧橡酸调至pH4，加入200目聚酌胶粉0.5g1.0 g，充分搅拌使色素完全吸附后，用30mL40 mL酸性水洗入50mL离心管
24、，离心，弃上层液体。沉淀物反复用酸性水洗涤3次41次后，用适量酸性水洗入含滤纸的漏斗中。用乙醇氨溶液洗脱色素，将洗脱液水浴蒸干，用适量的水加热溶解色素，用水洗入10mL容量瓶并定容。13.2 测定13.2.1 极谱条件2滴苯电极，一阶导数，三电极制，扫描速度250mV/s，底液A的初始扫描电位为0.2 V，终止扫描电位为一O.9 V。参考峰电位为克莱红-0.42 V、日落黄-0.50 V、拧橡黄0.56 V、姻脂红0.69 V、能蓝0.29 V。底液B的初始扫描电位为0.0V，终止扫描电位为1.0V。参考峰电位(溶液、底液偏酸使出峰电位正移，偏碱便出峰电位负移):能蓝0.16 V、日落黄0.3
25、2 V、拧橡黄0.45 V、亮蓝0.80 V。13.2.2 标准曲线:吸取着色剂标准使用溶液。，0.50，1.00 , 2. 00 ,3. 00 ,4. 00 mL分别于10mL比色管中，加入5.00mL底液，用水定容至10.0mL(浓度分别为O，50，1.00，2.00，3.00，00吨/mL)，混匀后于微机极谱仪上测定。为试J!iJ空白溶液。13.2.3 试样测定z取试样处理液1.00 mL，或一定量(复合色素峰电位较近时，尽量取稀溶液)，加底液5.00 mL，加水至10.00mL，摇匀后与标准系列溶液同时测定。14 计算试样中着色剂的含量按式(3)进行计算。式中zx -:-:_2:0:_l_:JlJ -m X V, X V2 X 1 000 X 1 000 X 试样中着色剂的含量，单位为克每升或克每千克(g/L或g/kg), -试样测定液中着色剂的含量，单位为微克每毫升(g/mL), m 试样取样质量或体积，单位为克或毫升(g或mL)，V, 试样测定液中试样处理液的体积，单位为毫升(mL)，V2 试样稀释后的总体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留两位有效数字。15 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。.( 3 ) 283
