1、昭通市地方标准DB5306/T 94-2023马铃薯金线虫田间监测技术规范2023-02-15 发布2023-04-06 实施昭通市市场监督管理局发 布DB5306ICS 65.020CCS B 05DB5306/T 94-2023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由昭通市植保植检站提出。本文件由昭通市农业农村局归口。本文件起草单位：昭通市植保植检站，中国农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：许翀、彭德良、杨毅娟、彭焕、宋家雄、李永青、陈敏、黄文坤、张汉学、普松权、王琴、李平松、郭威、李兴松、梅焱、徐松、邓磊、卢绘
2、娟、陈永燕、马列、马永琼、姚光禄、罗道瑛。DB5306/T 94-20231马铃薯金线虫田间监测技术规范1范围本文件规定了马铃薯金线虫田间监测技术的术语和定义、试剂和设备、监测方法、形态学鉴定、调查记录、注意事项。本文件适用于昭通市马铃薯种植区马铃薯金线虫田间监测调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 1723.1-2022 马铃薯金线虫和马铃薯白线虫检疫鉴定方法SN/T 2757植物线虫检测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1马铃薯
3、金线虫主要为害马铃薯并可寄生在番茄、茄子和烟草等多种茄科植物上的一种球孢囊线虫。3.2孢囊孢囊类线虫发育过程中的特殊阶段，为雌虫死亡后形成的褐色虫体，体内充满卵。4 试剂和设备4.1 主要试剂蔗糖，高岭土，甘油，盐酸，甲醛，酸性品红等。4.2 主要设备4.2.1 标准网筛：孔径 0.9mm、0.2mm 和 0.0308mm。4.2.2 生物显微镜：40600 倍。4.2.3 体视显微镜：10120 倍。5 监测方法5.1 系统调查5.1.1 调查点设定选择具马铃薯金线虫为害后症状的马铃薯地块23块，每块666.7m2以上，作为系统调查固定观察点。DB5306/T 94-202325.1.2 孢
4、囊及卵量调查在马铃薯播种前或马铃薯收获后，采用“Z”形或“五点”采样法，取5cm20 cm的根际土壤，每个样点取土量不少于0.5kg，将所取土样充分混合后，“四分法”取1kg左右装入样品袋，注明采样时间、地点等，室内摊开自然风干。称取200g风干土样，采用简易漂浮法（参见B.2）分离土壤中孢囊，在体视显微镜下计数。随机挑取、轻轻挤破10个孢囊，释放出卵，制备卵悬浮液，计算每克土样中的卵量，调查结果记入表C.1。5.1.3 发育进度调查在重点区域设立固定监测点，从马铃薯种植出苗至收获期间，每 20d 调查 1 次，其中初花期、盛花期、谢花末期应各调查 1 次。每次挖取 2 株马铃薯，将所采马铃薯
5、的根剪下后漂洗干净，用 40%甲醛液固定，采用酸性品红法染色，方法参见附录 D。在体视显微镜下观察根内线虫的发育进度，调查结果记入表 C.2。5.1.4 雌虫调查5.1.4.1 调查方法马铃薯盛花期、谢花末期采用“Z”形或“五点”取样法。每点5株，计数单株根系上的雌虫数。5.1.4.2 严重度分级根据马铃薯根部雌虫的数量，将马铃薯金线虫病发生程度分为5级。0级：无雌虫，无孢囊，无病；1级：轻度感染（每株雌虫110个）；2级：中度感染（每株雌虫11 30个）；3级：重度感染（每株雌虫31 100个）；4级：危重感染（每株雌虫100个以上）。5.1.4.3 病情指数病情指数按式（1）进行计算：.（
6、1）式中：I 病情指数；di 严重度级值；li 各级病株数；P 调查总株数；D 严重度最高级别值。5.1.4.4 结果记录雌虫调查结果记入表C.3。5.2 大田抽查100(DPldIii）DB5306/T 94-202335.2.1 抽查时间在马铃薯种植前、开花期和盛花期。5.2.2 抽查方法按低、中、高风险区、不同品种选择调查田，每种区域调查数量分别不少于10块、20块、30块。种植前取土样调查，大田雌虫抽查取样方法同5.1.4，抽查结果记入表C.4。6 鉴定方法6.1 样品采集马铃薯等植株出现黄化、矮化，开花期后根部出现先白色、后金黄色雌虫，采集根系和根际土壤样品进行室内鉴定。为害症状参见
7、附录A。6.2 形态学鉴定6.2.12龄幼虫和孢囊分离分离样品中的2龄幼虫和孢囊。分离方法参见附录B。6.2.2 标本制作按照SN/T 2575和SN/T 1723.1-2022 规定的方法制作。6.2.3 显微镜观察在显微镜下观察孢囊、2龄幼虫、雌虫和雄虫的形态特征，并拍照。6.2.4 形态学鉴别特征按照SN/T 1723.1-2022 规定的鉴别特征进行识别。6.2.5 结果判定按照SN/T 1723.1-2022 规定的要求判定。7调查记录详细记录调查方法和鉴定过程，并存档。8注意事项8.1 田间取样田间需防护取样，避免鞋、袜、衣服、取样工具等带土出田，防止取样时传播该病害。8.2 检测
8、后样品处理检测后的样品，需在水沸腾的情况下煮或蒸0.5h以上，才能作为垃圾处理。DB5306/T 94-20234附录A（资料性）马铃薯金线虫为害症状和形态学特征A.1 为害症状马铃薯金线虫为害马铃薯的根系，地上部无特殊识别症状，根系受害引起植物逆境反应，使水分和营养物质的吸收能力降低，地上部表现为水分和无机营养缺乏症状，地上部矮化、叶边缘发黄焦枯和其它失绿症状；在干旱条件下叶片表现凋萎症状，中午时分凋萎症状表现特别明显。金线虫危害后常常使马铃薯早衰和侧根增生。田间病株分布不均匀，有发病中心团。随着连续种植马铃薯和农事操作，病团年年扩大，最后全田发病，并从一块田传到另一块田。田间病害诊断最主要
9、的是进行金线虫的孢囊调查。在马铃薯开花前后，取植株根系，仔细观察受害植株的根部可见到金黄色的球形雌虫，故称马铃薯金线虫(potato golden cyst nematode)，雌虫成熟后逐步变成深褐色，马铃薯收获后，根系孢囊遗落到土壤中。见图A.1、图A.2。图 A.1马铃薯金线虫孢囊DB5306/T 94-20235图 A.2 马铃薯金线虫危害症状A.2 形态学特征按 SN/T 1723.1-2022 规定的鉴别特征进行识别。A.2.1 马铃薯金线虫形态特征测量值据 Stone(1973)研究报道，马铃薯金线虫雌虫、雄虫、幼虫的形态测量值如下：雌虫(n25)：体长(不包括颈)520(420
10、-640)m，口针长 21.7-24.1m，口针基部至背食道腺开口的距离为 4.8-6.6m，头基部宽 4.5-5.9m,头端至中食道球瓣门的距离为 58.6-87.8m，中食道球瓣门至排泄孔的距离为 45.0-85.4，头端至排泄孔 127.9-162.7m，中食道球平均直径 27.2-32.8m,阴门膜孔直径19.6-25.2m，阴门裂长 7.8-11.6m，肛门至阴门膜边缘距离 59.0-61.0m，肛门至阴门间角质层脊数目为 18.1-25.1。孢囊(n=25)：体长(不包括颈)395-495m，宽 376-388m，颈长 85-123m，阴门锥直径 16.6-21.0m，肛门至阴门锥
11、 56.2-76.8m，格氏比值(Graneks ratio，肛门至阴门锥近缘的距离/阴门锥直径)2.8-4.4m(Stone,1973)。雄虫(n=50)：体长 1097-1297m，排泄孔处体宽 25.4-29.8m，头基部宽 11.2-12.4m,头高 6.5-7.1m，口针长 24.9-26.7m，口针基部到背食道腺开口的距离为 4.4-6.2m，头端到中食道球瓣门距离91.1-105.9m，中食道球瓣门至排泄孔的距离为 64.8-82.8m，头端到排泄孔距离 160.2-184.4m，尾长4.3-6.5m，泄殖腔处体宽 13.1-13.9m，交合刺长 32.7-38.3m，引带长 8
12、.8-11.8m(Stone,1973)。2 龄幼虫(n=50)：体长 448-488m，排泄孔处体宽 17.8-18.8m，基部头宽 9.5-10.3m，头高 4.1-5.2m，头端到中食道球瓣门距离 67.3-71.1m，口针长 21.1-22.6m，口针基部到食道腺开口的长度为 2.0-3.2m，中食道球瓣门至排泄孔距离 29.0-33.6m，头端至排泄孔 98.1-102.9m，尾长 32.3-55.5m，透明尾长DB5306/T 94-2023624.7-28.3m，肛门处体宽 10.8-12.0m(Stone,1973)。A 2.2马铃薯金线虫形态描述雌虫：亚球形，具突出的颈（见图
13、 A.3.I），虫体球形部分的角质层具有网状脊，无侧线。口针锥部约为口针长度的 50%，有时略弯曲，口针基部球圆形，明显向后倾斜。排泄孔明显，位于颈基部。阴门膜略凹陷，阴门横裂状。肛门位于阴门膜之外，肛门与阴门间角质层有 20 个平行脊(Stone,1973)。2 龄幼虫：蠕虫形（见图 A.3.A-D），但在卵内折叠成 4 折，角质层环纹明显，侧区 4 条侧线，偶尔有网格化。头圆，稍微缢缩，46 个环纹。口盘卵圆形，侧唇和一对背腹亚中唇环绕口盘。口盘和唇形成卵圆形轮廓。头骨架严重骨化，前、后头状体分别位于第 23 个和第 68 个体环处。口针发育好，口针锥部小于口针长的 50%，口针基部球略向
14、后倾斜，食道腺体在腹面延伸至排泄孔后 35%体长处，排泄孔位于 20%体长处，半月体 2 个体环长，位于排泄孔前 1 个环纹处，半月小体小于 1 个体环长，位于排泄孔后 56 个环纹处。4 个生殖腺细胞(gonadial primordium)几乎位于 60%体长处，尾部渐变尖细。孢囊：亚球形具突出的颈（见图 A.3.H），无突出的阴门锥；阴门锥为单环膜孔型(singlecircumfenestra)，新孢囊的阴门锥完整，较老的孢囊部分或全部阴门锥丢失。无阴门桥、下桥及其它残存的腺体结构；无泡状突，但阴门区域可能有一些小而不规则黑色素沉积物。无亚晶层，角质膜与雌虫相似，为Z字型(Stone,1
15、973）。雄虫：蠕虫形，具钝圆形的尾，热杀死固定时，虫体弯曲，后部卷曲 90o180 o，呈“C”形或“S”形（见图 A.3.E,F,G,J)，角质层具规则环纹，侧区 4 条侧线延伸至尾末端，两条外侧线具网纹但内侧线无网纹。头部圆形缢缩，具 67 个环纹，头骨架严重骨化。前头状体(anterior cephalids)和后头状体分别位于 24 和 69 个体环处。口针发育好，基部球向后倾斜，口针锥部占整个口针长的 45%。中食道球椭圆形，中间有明显的新月形瓣门，无明显的食道肠瓣状结构。半月体 2 个环纹长，位于排泄孔前23 个环纹处，半月小体 1 个环纹长，位于排泄孔后 912 个体环处。单精
16、巢，泄殖腔开口小，具升起的唇。交合刺强壮，弓形，末端单指尖状。引带小(Stone,1973)。DB5306/T 94-20237图 A.3 马铃薯金线虫 Globodera rostochiensis（Wollenweber,1923）A 幼虫整体；B 2 龄幼虫头部区域；C 2 龄幼虫中部侧区；D 2 龄幼虫食道区域；E 雄虫食道区域；F 雄虫尾部；G 雄虫虫体中部侧区；H 孢囊；I 雌虫头部和颈部；J 雄虫整体。(引自 Stone，1973)DB5306/T 94-20238附录B（资料性）马铃薯金线虫的分离方法B.1 浅盘法分离2龄幼虫B.1.1 将采集的土壤样品铺于干净的浅瓷盘内，充分
17、混匀备用；B.1.2 将塑料筐或不锈钢网筛放入配套的浅盘中，筛网上放置一层面巾纸，然后用量杯量取100 mL土样均匀铺在面巾纸上，在浅盘中加水至刚刚浸没土壤，置于室温条件下放置24h，防止水分完全蒸发，随时补水。B.1.3 将浅盘中的水通过0.0308mm网筛倒出，再用弱水流冲洗将线虫混合液聚集在网筛的边缘。B.1.4 用洗瓶小心将线虫混合液收集至烧杯中，静置后，去除上清，即可得到大量2龄幼虫。B.2 漂浮法分离土壤中孢囊B.2.1 待分离土样风干后，充分混匀，取 200g 土壤加入 5L 水中充分搅拌，使孢囊漂浮，停止搅拌，静置 30s60s；B.2.2 将上层的悬浮液经过 0.9mm 网筛
18、倾倒入 0.2mm 网筛，用强水流冲洗 0.9mm 网筛上的残渣，收集0.2mm 网筛上的粗样品；B.2.3 冲洗0.2mm网筛上的收集物后，淋洗到铺有滤纸的漏斗中，滤去水分待滤纸晾干后即可在体视显微镜下观察，将滤纸上的孢囊用毛刷等转移到另一铺有湿滤纸的培养皿中进行鉴定和计数。DB5306/T 94-20239附录C(规范性附录)马铃薯金线虫调查资料表册C.1 马铃薯金线虫孢囊及卵量系统调查马铃薯金线虫孢囊及卵量系统调查表见表C.1。表 C.1 马铃薯金线虫孢囊及卵量系统调查表调查日期田块(编号)马铃薯品种孢囊数（个）孢囊密度（个/克土）10个孢囊卵量（粒）卵密度（粒/克土）调查地点：调查单位
19、：调查人：C.2 马铃薯金线虫发育进度调查马铃薯金线虫发育进度调查表见表C.2。表 C.2 马铃薯金线虫发育进度系统调查表调查日期马铃薯品种播种日期生育期每株马铃薯根内不同龄期幼虫数量（条）备注2龄幼虫3龄幼虫4龄幼虫调查地点：调查单位：调查人：DB5306/T 94-202310C.3 马铃薯金线虫雌虫发生情况调查马铃薯金线虫雌虫系统调查表见表C.3。表 C.3 马铃薯金线虫雌虫系统调查表C.4 马铃薯金线虫大田雌虫发生情况抽查马铃薯金线虫大田雌虫发生情况抽查统计表见表C.4。表 C.4 马铃薯金线虫大田雌虫发生情况抽查统计表调查日期田块类型调查面 积（亩）发病面积（亩）马铃薯品种播种日期调
20、查株数（株）发病株数（株）雌虫数（个）不同级别株数，株病情指数备注01234平均病田率（%）平均病株率（%）调查地点：调查单位：调查人：调查日期马铃薯品种播种日期调查株数（株）发病株数（株）病株率（%）雌虫数（个）不同级别株数（株）病情指数备注01234调查地点：调查单位：调查人：DB5306/T 94-202311附录D（资料性）酸性品红染色法D.1 染色液配置D.1.1 5.25%NaClO 溶液。D.1.2 酸性品红储存液：3.5g 酸性品红溶于 250mL 醋酸，待完全溶解后，用蒸馏水定容至 1L。D.1.3 酸性甘油液：20mL30mL 纯甘油中滴加 2-3 滴 5mol/L 盐酸溶液。D.2 染色步骤D.2.1 将洗净的根系组织放入烧杯内，加入 50mL 蒸馏水以及 10mL5.25%NaClO 溶液。D.2.2 用玻璃棒搅拌根组织 5min，取出根组织用流水冲洗 1min，然后将根转入到 100mL 的蒸馏水中，浸泡 15min。D.2.3 将根组织转入另一个盛有 30mL50mL 蒸馏水的烧杯中，加入 1mL 酸性品红储存液，微波炉中煮沸 30s。D.2.4 冷却后，根系用流水漂洗，置于酸性甘油中褪色。D.2.5 显微镜下观察。_
