1、 ICS 65.020 CCS B 16 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 31482023 油菜籽携带黑胫病菌分子检测技术规程 Technical code of practice for molecular detection of leptosphaeria spp.from contaminated oilseed rape 2023-08-25 发布2023-09-25 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 31482023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出
2、。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、特泥河农牧场有限公司、巴彦淖尔市乌拉特中旗现代农牧事业发展中心、呼和浩特市园林植保站。本文件主要起草人：宋培玲、李子钦、燕孟娇、杨永青、贾晓清、皇甫海燕、霍宏丽、赵丽丽、郭晨、皇甫九茹、张英、袁喜丽、斯琴、高树娟。DB15/T 31482023 1 油菜籽携带黑胫病菌分子检测技术规程 1 范围 本文件规定了油菜籽携带黑胫病菌的分子检测方法，主要包括样品 DNA 提取、PCR 扩增检测、琼脂糖凝胶电泳、结果判定。本文件适用于油菜籽携带黑胫病菌的检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性
3、引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。油菜黑胫病 phoma stem canker of rapeseed 由小球腔菌属真菌Leptosphaeria maculans或Leptosphaeria biglobosa侵染引起的油菜病害，危害叶片和茎秆。L.biglobosa 致病性较弱，侵染油菜叶片和茎秆后，形成黑色病斑，病斑上散有零星的小黑点（分生孢子器），叶片上病斑的周围可见有黄色晕圈。L.maculans 致病性较强，侵染油菜叶片后，形成大的、黑褐色病斑，上面分布有较多的小黑点（分生孢子器），后期在茎基部也能形成病斑，从而造成茎基部的腐烂。4 主要仪器设备和试剂 主要仪
4、器设备 高压灭菌锅、超纯水系统、制冰机、水浴锅、电泳仪、PCR 仪、凝胶成像系统、超低温冰箱、常规冰箱、离心机、涡旋振荡器、移液器。主要试剂 4.2.1 DNA 提取试剂：QIAGENs mini kit 提取试剂盒，CTAB 提取液（1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA pH 8.0，2%CTAB），氯仿，异戊醇，醋酸钠，异丙醇，乙醇。4.2.2 PCR 检测试剂：10PCR 缓冲液，Taq 酶，dNTP，dd H2O。4.2.3 凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，loading buffer，核酸染料。5 样品 DNA
5、 提取 DB15/T 31482023 2 随机抽取 0.5 g 油菜籽置于冷冻过的研钵中，液氮迅速研磨后将粉末分装到 1.5 mL 的离心管中，先用 CTAB 法提取 DNA，再用 QIAGENs plant mini kit 试剂盒提取 DNA。6 PCR 扩增检测 特异性引物：LmacA:5，CTTGCC CACCAA TTGGAT CCCCTA 3，LmacB:5，ATCAGG GGATTG GTGTCA GCAGTT GA 3，LmacR：5，GCAAAA TGTGCT GCGCTC CAGG 3，LmacR 为共用反向引物，强致病性病原菌 L.maculans 可获得大小为 334
6、 bp 的特异性扩增产物，弱致病性病原菌 L.biglobosa 可获得大小为 440 bp 的特异性扩增产物。扩增体系(20 L)：基因组 DNA 2 L，上下游引物（10 M）各 1 uL，10 LTaqmix(2x),MQ 6 L。扩增条件：94 预变性 2 min,94 变性 30 s,58.5 退火 30 s,72 延伸 1 min；35 个循环；72 延伸 5 min.7 琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加入 1%琼脂糖，加热融化后冷却至 55 左右加入 5 L 核酸染料摇匀，倒入胶板制备凝胶，凝固后上样进行电泳。8 结果判定 在空白对照不出现任何条带的前提下，如果待测样本PCR获得大小为334 bp的条带，鉴定为强致病性病原菌L.maculans，如果PCR获得大小为440 bp的条带，鉴定为弱致病性病原菌L.biglobosa。
