1、I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 353云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 2代 替 D B 5 3/T 4 4 7.5-2 0 1 2云 岭 牛 第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产2 0 2 2-0 5-2 0 发 布 2 0 2 2-0 8-2 0 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 2I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。
2、本 文 件 为 D B 5 3/T 4 4 7 2 0 2 2 云 岭 牛 的 第 5 部 分。D B 5 3/T 4 4 7 已 经 发 布 了 以 下 部 分：第 1 部 分：品 种；第 2 部 分：养 殖 场 建 设 规 范；第 3 部 分：人 工 授 精；第 4 部 分：胚 胎 移 植；第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产；第 6 部 分：饲 养 管 理；第 7 部 分：饲 草 加 工 与 调 制 技 术；第 8 部 分：育 肥 技 术；第 9 部 分：疫 病 防 治；第 1 0 部 分：档 案 管 理；第 1 1 部 分：胴 体 生 产、评 定 及 分 割 技 术。本 文 件 代
3、替 D B 5 3/T 4 4 7.5-2 0 1 2 B M Y 牛 第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产，与 D B 5 3/T 4 4 7.5-2 0 1 2 相比，除 结 构 调 整 和 编 辑 性 改 动 以 外，主 要 技 术 变 化 如 下：a)更 改 标 准 名 称 为“云 岭 牛；b)更 改 全 文“B M Y 牛”为“云 岭 牛”；c)“术 语”中 增 加 了 英 文 名 称（见 第 3 章）；d)更 改 了“主 要 器 具、耗 材”中 部 分 表 述（见 4.3）；e)更 改 了“采 卵 装 置 和 器 具”中 部 分 表 述（见 6.1.1.1），删 除“酒 精 棉
4、球”（见 2 0 1 2 版6.1.1.1）；f)更 改 了“采 卵”中 部 分 表 述（见 6.1.2）；g)更 改 了“采 卵 频 率”中 部 分 表 述（见 6.1.3）；h)更 改 了“主 要 材 料”表 述 顺 序（见 6.2.1）；i)更 改 了“卵 巢 的 收 集”中 部 分 表 述（见 6.2.3）；j)更 改 了“卵 母 细 胞 的 检 出”中 部 分 表 述（7.1）；k)更 改 了“卵 母 细 胞 的 分 级”中 部 分 表 述（见 7.2.1）；l)更 改 了“受 精 卵 的 清 洗 和 体 外 发 育 培 养”中 部 分 表 述（见 1 0.2.1、1 0.2.2）。
5、本 文 件 由 云 南 省 草 地 动 物 科 学 研 究 院 提 出。本 文 件 由 云 南 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 7）归 口。本 文 件 起 草 单 位：云 南 省 草 地 动 物 科 学 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：和 占 星、黄 必 志、王 安 奎、金 显 栋、刘 建 勇、张 继 才、黄 梅 芬、王 喆、亐 开 兴、杨 世 平、赵 刚、杨 凯、袁 希 平、杨 寿 军。本 文 件 及 其 所 代 替 文 件 的 历 次 版 本 发 布 情 况 为：2 0 1 2 年 首 次 发 布；本 次 为 第 一 次 修 订。D B 5 3/
6、T 4 4 7.5 2 0 2 2I I I引 言D B 5 3/T 4 4 7-2 0 2 2 云 岭 牛 是 以 2 0 1 4 年 1 2 月 国 家 审 定 新 品 种“云 岭 牛”为 载 体 制 定 的 综 合 养殖 标 准，旨 在 从 品 种、养 殖 场 建 设、繁 殖、管 理、饲 草 加 工 调 制、育 肥、疫 病、档 案 和 胴 体 评 定 分割 等 方 面 指 导 和 规 范 云 岭 牛 的 养 殖，带 动 云 岭 牛 规 范 化、标 准 化、产 业 化 发 展 的 同 时，可 提 高 养 殖场（户）养 殖 水 平 和 养 殖 效 益，促 进 云 南 肉 牛 产 业 高 质
7、量 发 展。D B 5 3/T 4 4 7-2 0 2 2 由 十 一 个 部 分 构 成。第 1 部 分：品 种。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 特 征 和 特 性、生 产 性 能、种 牛 等 级 和 良 种 登 记，适 用于 云 岭 牛 品 种 鉴 定 和 种 牛 等 级 评 定。第 2 部 分：养 殖 场 建 设 规 范。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 选 址、规 划 与 布 局、牛 舍 建 设 和 辅 助 设 施建 设 等 技 术 要 求。第 3 部 分：人 工 授 精。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 种 公 牛 选 择、母 牛 的 初 配 年 龄 与 发 情 鉴 定、输
8、精方 法、母 牛 妊 娠 诊 断 等 技 术 要 求。第 4 部 分：胚 胎 移 植。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 快 速 扩 繁 受 体 牛 同 期 发 情、供 体 牛 超 数 排 卵 与 输精、胚 胎 回 收、胚 胎 质 量 鉴 定、胚 胎 冷 冻 保 存 与 解 冻、胚 胎 移 植、受 体 牛 妊 娠 诊 断 等 技 术 要求。第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 供 体 牛 的 选 择 与 饲 养 管 理、卵 母 细 胞 的 获 取、卵 母 细 胞 的 检 出 与 分 级、卵 母 细 胞 的 I V M、卵 母 细 胞 的 I V F、受 精
9、 卵 的 I V C 等 技 术 要 求。第 6 部 分：饲 养 管 理。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 饲 养 管 理 的 基 本 要 求 以 及 牛 场 卫 生、各 类 牛 的 饲养 管 理 等 技 术 要 求。第 7 部 分：饲 草 加 工 与 调 制 技 术。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 养 殖 过 程 中 青 贮 饲 料、秸 秆 氨（碱）化 饲 料、青 干 草 饲 料 的 加 工 调 制 技 术 要 求。第 8 部 分：育 肥 技 术。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 优 质 牛 肉 生 产 和 雪 花 牛 肉 生 产 技 术 要 求。第 9 部 分：疫 病 防 治。目
10、的 在 于 确 立 云 岭 牛 的 生 物 安 全、牛 场 消 毒、疫 病 防 治 及 无 害 化 处 理等 技 术 要 求。第 1 0 部 分：档 案 管 理。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 养 殖 过 程 中 建 档 范 围、内 容 及 档 案 管 理 的 技 术 要求。第 1 1 部 分：胴 体 生 产、评 定 及 分 割 技 术。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 胴 体 生 产、评 定、分 割 以 及 分割 肉 包 装 等 技 术 要 求。D B 5 3/T 4 4 7-2 0 2 2 包 含 的 十 一 部 分 内 容 均 是 符 合 生 产 实 际 需 要，涵 盖 了 生 产
11、 环 节 中 的 品 种、养殖 场 建 设、繁 殖、饲 养 管 理、饲 草 加 工 调 制、育 肥、疫 病 防 治、档 案 管 理 和 胴 体 生 产、评 定 及 分 割多 方 面 技 术。该 标 准 可 规 范 云 岭 牛 从 养 殖 场 到 牛 肉 产 品 的 全 系 列 生 产 技 术，充 分 发 挥 云 岭 牛 生 产 性能，提 高 养 殖 水 平，促 进 规 模 化 标 准 化 养 殖 的 构 建 和 肉 牛 产 业 的 发 展。D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 21云 岭 牛 第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产1 范 围本 文 件 规 定 了 云 岭 牛 供 体
12、的 选 择 与 饲 养 管 理、卵 母 细 胞 的 获 取、卵 母 细 胞 的 检 出 与 分 级、卵 母 细 胞的 I V M、卵 母 细 胞 的 I V F、受 精 卵 的 I V C 等 技 术 要 求。本 文 件 适 用 于 牛 体 外 胚 胎 生 产 和 移 植 技 术 操 作。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（
13、包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。D B 5 3/T 4 4 7 云 岭 牛 第 4 部 分：胚 胎 移 植3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1活 体 采 卵 o v u m p i c k u p借 助 超 声 波 探 测 器 或 内 窥 镜，直 接 从 供 体 牛 活 体 卵 巢 中 采 集（吸 取）未 成 熟 的 卵 母 细 胞。3.2体 外 受 精 in vitro f e r t i l i z a t i o n在 体 外 培 养 条 件 下 完 成 卵 母 细 胞 的 成 熟、受 精、以 及 受 精 卵 发 育 成
14、可 移 植 胚 胎。其 过 程 包 括 卵 母 细胞 的 体 外 成 熟（In vitro m a t u r a t i o n，I V M）、体 外 受 精（In vitro f e r t i l i z a t i o n，I V F）和 受 精 卵 的 体 外 发 育培 养（In vitro c u l t u r e，I V C）。3.3体 外 胚 胎 生 产 in vitro e m b r y o p r o d u c t i o n以 I V M、I V F 和 I V C 连 续 步 骤 生 产 胚 胎 的 过 程，称 为 体 外 胚 胎 生 产（In vitro e m
15、 b r y o p r o d u c t i o n，I V P）。4 设 施、仪 器 及 器 具、耗 材4.1 主 要 设 施胚 胎 工 程 实 验 室、采 卵 室、分 牛 栏、保 定 架 等。4.2 主 要 仪 器超 净 工 作 台、超 纯 水 仪、高 压 灭 菌 仪、干 热 灭 菌 仪、E O 灭 菌 仪、超 低 温 冰 箱、电 冰 箱、电 子 天 平、倒 置 显 微 镜、实 体 显 微 镜、C O2培 养 箱、活 体 采 卵 装 置、胚 胎 冷 冻 仪、恒 温 台、水 浴 锅、细 胞(胚 胎)培养 运 输 仪、液 氮 罐、p H 测 定 仪、封 口 机 等。4.3 主 要 器 具、
16、耗 材D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 22硅 化 瓶、烧 杯、量 筒、过 滤 灭 菌 滤 器（0.2 2 u m，0.4 5 m）、酒 精 灯、离 心 管（1 0 m L 或 1 5 m L、5 0 m L）、培 养 皿、注 射 器（1 m L、5 m L、1 0 m L、2 0 m L、5 0 m L）、检 卵 器 或 微 细 玻 璃 管、巴 氏 玻 璃 管、记 号 笔、计 时 器；过 滤 式 集 卵（胚）杯、手 术 器 具 一 套（毛 剪、止 血 钳、镊 子 等）、塑 料 细 管 专 用 剪、塑 料 细 管（0.2 5 m L）、胚 胎 解 冻 杯 和 温 度 计、胚 胎
17、移 植 枪、移 植 枪 加 外 套 和 保 护 膜、7 5%酒 精 棉 球 等。5 供 体 牛 的 选 择 与 饲 养 管 理供 体 牛 的 选 择 参 照 D B 5 3/T 4 4 7.4 的 规 定 执 行。供 体 牛 的 饲 养 管 理 参 照 D B 5 3/T 4 4 7.4 的 规 定 执 行。6 卵 母 细 胞 的 获 取6.1 获 取 方 式从 活 体 供 体 牛 卵 巢 中 采 集（活 体 采 卵）或 从 屠 宰 后 母 牛 离 体 卵 巢 中 采 集 卵 母 细 胞。6.2 活 体 采 卵（O P U）6.2.1 采 卵 前 的 准 备6.2.1.1 装 置 和 器 具B
18、 型 超 声 波 扫 描 仪、扇 形 阴 道 探 头（7.5 M H z）、真 空 泵 和 恒 温 器；1 6 G、1 7 G、1 8 G 金 属 采 卵 针、回收 管、5 0 m L 离 心 管（集 收 杯）、一 次 性 注 射 器（5 m L、1 0 m L）等。6.2.1.2 麻 醉 剂2%利 多 卡 因 或 普 鲁 卡 因。6.2.1.3 采 卵 液D-P B S+1 0 I U/m L 肝 素 钠+1%F C S+青 霉 素 1 0 0 I U/m L+1 0 0 g/m L 链 霉 素。6.2.1.4 采 卵 装 置 的 调 试将 采 卵 装 置 按 要 求 安 装 好，并 调 试
19、 到 正 常 工 作 状 态，同 时 把 采 卵 液 及 其 它 必 需 物 品 在 专 用 台 车 或 工作 台 上 摆 放 好。6.2.1.5 供 体 牛 的 保 定 与 麻 醉按 D B 5 3/T 4 4 7.4 的 规 定 执 行。6.2.2 采 卵按 以 下 步 骤 采 卵：a)用 右 手 将 B 超 探 头 轻 缓 地 插 入 母 牛 阴 道 子 宫 颈 一 侧 的 穹 隆 处，并 把 握 好；b)左 手 插 入 直 肠，用 手 隔 着 直 肠 壁 找 到 卵 巢，并 将 其 贴 近 探 头 面 上，通 过 B 超 显 示 屏 观 察 卵 巢是 否 正 常，记 录 卵 泡 的 数
20、 目 及 其 大 小；c)将 吸 满 采 卵 液 的 单 腔 采 卵 针 插 入 装 在 探 头 上 的 采 卵 针 筒 中；d)用 直 肠 中 的 左 手 移 动 卵 巢 使 穿 刺 目 标 卵 泡 位 于 B 超 显 示 屏 中 显 示 的 采 卵 线 上，根 据 B 超 显 示屏 上 所 显 示 的 目 标 卵 泡 位 置，用 把 握 探 头 的 右 手 手 指 推 动 进 针 管 进 行 穿 刺（针 头 刺 穿 阴 道 壁D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 23和 卵 泡 壁）的 同 时 踩 下 脚 踏 开 关 将 卵 母 细 胞 及 卵 泡 液 一 同 吸 到 置 于 恒
21、 温 器 中 收 集 管 内（3 7 C恒 温）；e)穿 刺 目 标 卵 泡 为 直 径 2 m m 8 m m；f)吸 卵 时 真 空 泵 压 力 8 0 m m H g 8 5 m m H g。6.2.3 采 卵 频 率根 据 实 际 需 要 可 采 用 每 周 1 次 2 次、每 月 一 次 或 在 母 牛 集 中 配 种 前 随 机 选 择，批 量 采 卵。6.3 从 屠 宰 后 母 牛 离 体 卵 巢 中 采 集 卵 母 细 胞6.3.1 主 要 材 料保 温 箱（壶）、止 血 钳、手 术 剪、乳 胶 手 套、注 射 器、针 头、离 心 管、注 射 器 用 灭 菌 过 滤 器（0.2
22、 5 m）等。6.3.2 卵 巢 保 存 液灭 菌 的 P B S 液 或 生 理 盐 水+1 0 0 m g 硫 酸 卡 那 霉 素。6.3.3 卵 巢 的 收 集母 牛 屠 宰 后 3 0 m i n 内 采 集 卵 巢，用 卵 巢 保 存 液 冲 洗 2 次 3 次 后 放 入 盛 有 3 3 C 保 存 液 的 保 温 瓶 内 保存，尽 快 带 回 实 验 室。6.3.4 卵 母 细 胞 的 吸 取按 以 下 步 骤 进 行 卵 母 细 胞 的 吸 取：a)以 P B S 液 1 0 0 m L+青 霉 素 1 0 0 万 单 位、链 霉 素 1 0 m g，过 滤 灭 菌 配 置 采
23、 卵 液，装 瓶 后 放 入 3 3 C 的 恒 温 槽 内 待 用；b)清 理 卵 巢 上 粘 着 的 脂 肪 等 组 织，用 保 存 液 冲 洗 2 次 3 次，放 入 加 有 卵 母 细 胞 清 洗 液（含 量0.3%B S A 的 B O 液（见 9.1.1）的 烧 杯 后 暂 置 入 3 3 C 恒 温 槽 内；c)用 带 1 8 G 或 2 0 G 针 头 的 1 0 m L 注 射 器 吸 取 2 m m 8 m m 卵 泡 的 卵 泡 液，注 入 到 1 5 m L 或 5 0 m L离 心 管 内 置 于 恒 温 槽 待 检 卵 和 分 类。7 卵 母 细 胞 的 检 出 与
24、 分 级7.1 卵 母 细 胞 的 检 出按 以 下 步 骤 检 出 卵 母 细 胞：a)收 集 到 的 卵 泡 液 倒 入 胚 胎 滤 杯 中，用 含 5%1 0%C S 或 F C S 的 P B S 液 的 洗 卵 液 稀 释，洗 涤 3 次 4 次，将 滤 杯 中 的 液 体 及 沉 淀 物 倒 入 培 养 皿 中；b)在 实 体 显 微 镜 下 检 出 卵 母 细 胞，如 使 用 带 有 侧 滤 网 的 胚 胎 滤 杯，则 可 直 接 在 其 中 检 卵；c)收 集 卵 质 色 泽 基 本 均 匀、卵 母 细 胞 周 围 有 1 层 数 层 卵 丘 的 卵 丘-卵 母 细 胞 复 合
25、 体（C u m u l u so o c y t e c o m p l e x e s,C O C s）放 入 盛 有 P B S 液 的 培 养 皿 中。7.2 卵 母 细 胞 的 分 级 与 选 用7.2.1 卵 母 细 胞 质 色 泽 均 匀，卵 母 细 胞 周 围 包 围 4 层 卵 丘 细 胞，卵 丘-卵 母 细 胞 复 合 体（T h e c u m u l u so o c y t e s c o m p l e x e s，C O C s）完 整 为 级。D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 247.2.2 卵 母 细 胞 质 色 泽 均 匀、卵 母 细 胞 周
26、围 包 围 3 层 卵 丘 细 胞，C O C s 完 整 为 级。7.2.3 卵 母 细 胞 质 色 泽 基 本 均 匀、卵 母 细 胞 周 围 包 围 1 2 层 卵 丘 细 胞，C O C s 基 本 完 整 为 级。7.2.4 卵 母 细 胞 质 色 泽 基 本 均 匀，卵 丘 细 胞 扩 散 或 半 裸、裸 卵 和 闭 锁 卵 为 级。7.2.5 选 择、级 卵 母 细 胞 用 于 体 外 成 熟 培 养。8 卵 母 细 胞 的 体 外 成 熟 培 养（I V M）8.1 体 外 成 熟 培 养 液 的 配 制T C M-1 9 9（1 9 m L）+C S 或 F C S 1 m
27、L+F S H 2 0 l（0.1 g/m L）或 E21 g/m L+抗 菌 素 2 0 l（青霉 素 1 0 万 I U/m L、链 霉 素 1 0 0 m g/m L），过 滤 灭 菌 后 备 用。8.2 C O C s 的 清 洗 与 体 外 成 熟 培 养（I V M）按 以 下 步 骤 进 行 C O C s 的 清 洗 与 体 外 成 熟 培 养（I V M）：a)用 I V M 培 养 液 在 3 5 m m 培 养 皿 中 制 成 1 0 0 l 微 滴 3 个 4 个 或 放 入 4 孔 培 养 皿 中，覆 盖 石 蜡油，在 C O2培 养 箱 中 平 衡 2 0 m i
28、n；b)C O C s 用 I V M 液 洗 涤 3 次，移 入 经 平 衡 的 培 养 微 滴 中（每 滴 1 5 枚 2 0 枚），在 5%C O2、9 5%空气、3 8.5 C、饱 和 湿 度 的 培 养 箱 中 培 养 2 2 h。9 卵 母 细 胞 的 体 外 受 精（I V F）9.1 精 子 的 制 备 与 获 能 处 理9.1.1 B O 液 的 配 制（修 正）9.1.1.1 B O 液 的 配 制（修 正）应 由 A 液 和 B 液 组 成。9.1.1.2 A 液：N a C l 4.3 0 9 2 g+K C l 0.1 9 7 4 g+C a C l20.2 1 7
29、1 g+N a H2P O40.0 8 4 0 g+M g C l20.0 6 9 7 g+0.5%酚 红 0.1 m L+超 纯 净 水 5 0 0 m L。9.1.1.3 B 液：N a H C O32.5 8 7 3 g+0.5%酚 红 0.0 4 m L+超 纯 净 水 2 0 0 m L，溶 解 后 C O2气 体 通 气 3 0 m i n作 气 相 平 衡。9.1.1.4 A 液 7 6 m L+B 液 2 4 m L+丙 酮 酸 钠 0.1 3 7 5 g+抗 菌 素 1 0 0 L（青 霉 素 1 0 万 I U/m L，链 霉素 1 0 0 m g/m L）+肝 素 钠 1
30、 3 0 L，过 滤 灭 菌 后 冷 藏 保 存。9.1.2 精 子 清 洗 液 配 制B O 液 5 0 m L+咖 啡 因 1 0 m m o l/L，过 滤 灭 菌。9.1.3 精 子 稀 释 液 配 制B O 液 1 0 m L+B S A（牛 血 清 白 蛋 白）0.0 6 g，过 滤 灭 菌。9.1.4 精 子 制 备 与 获 能按 以 下 步 骤 进 行 精 子 制 备 与 获 能：a)冻 精 用 3 7 C 3 8 C 水 浴 1 0 s 解 冻 后 倒 入 离 心 管 内，加 入 7 m L 精 子 清 洗 液，以 1 8 0 0 r.p.m.离 心 5 m i n；b)吸
31、弃 上 清 液，留 1 m L 2 m L，同 法 第 二 次 离 心 洗 涤，留 1 m L，加 1 m L 精 子 稀 释 液，使 稀 释后 的 精 子 数 达(5 1 0 6)个/m L；D B 5 3/T 4 4 7.5 2 0 2 25c)取 9 5 l 精 子 稀 释 液 注 入 到 5 L 卵 母 细 胞 清 洗 液 微 滴 中，使 之 成 为 1 0 0 L 的 精 子 培 养 微 滴，覆 盖 石 蜡 油；d)在 5%C O2、9 5%空 气、3 8.5 C、饱 和 湿 度 的 培 养 箱 内 预 培 养 1 h 1.5 h。9.2 卵 母 细 胞 的 体 外 受 精（I V
32、F）I V M 2 2 h 的 C O C s 用 卵 母 细 胞 清 洗 液 洗 涤 3 次，放 入 已 准 备 好 的 1 0 0 L 精 子 培 养 液 微 滴 中（每 滴 1 5 枚 2 0 枚），在 5%C O2、9 5%空 气、3 8.5 C、饱 和 湿 度 的 培 养 箱 内 受 精 5 h。1 0 受 精 卵 的 体 外 发 育 培 养（I V C）1 0.1 I V C 培 养 液（m-C R 1 a a）的 配 制N a C l 0.6 7 g+K C l 0.0 2 3 g+N a H C O30.2 2 g+半 乳 酸 钙 0.0 5 5 g+丙 酮 酸 钠 0.0 0
33、 4 g+谷 氨 酰胺 0.0 1 5 g+酚 红 0.0 0 0 5 g+必 需 氨 基 酸 1 m L+非 必 需 氨 基 酸 1 m L+超 纯 净 水 1 0 0 m L+抗 菌 素 1 0 0 l（青 霉 素 1 0 万 I U/m L，链 霉 素 1 0 0 m g/m L），过 滤 灭 菌，分 装 待 用。1 0.2 受 精 卵 的 清 洗 和 体 外 发 育 培 养按 以 下 步 骤 进 行 受 精 卵 的 清 洗 和 体 外 发 育 培 养：a)取 m-C R 1 a a 培 养 液 放 入 3 5 m m 培 养 皿 或 4 孔 培 养 皿 中，覆 盖 石 蜡 油 在 培
34、养 箱 中 平 衡 1 h；b)受 精 后 的 卵 母 细 胞 用 5%C S 的 m-C R 1 a a 培 养 液 清 洗 3 次；c)不 作 裸 化 处 理，保 留 1 层 2 层 卵 丘 细 胞，移 到 预 先 盛 有 m-C R 1 a a 培 养 液 的 1 0 0 L 微 滴 3 5 m m培 养 皿 或 盛 有 m-C R 1 a a 培 养 液 的 4 孔 培 养 皿 中，每 滴（孔）1 5 枚 2 0 枚；d)覆 盖 石 蜡 油 后 在 5%C O2、9 5%空 气、3 8.5 C 的 饱 和 湿 度 的 培 养 箱 内 I V C 7 d 8 d，定 期 观 察受 精 卵 裂 和 胚 胎 发 育 情 况；e)每 4 8 h 更 换 一 次 新 的 培 养 液，更 换 量 约 为 原 液 总 量 的 1/2。1 1 胚 胎 鉴 定按 D B 5 3/T 4 4 7.4 的 规 定 执 行。1 2 胚 胎 冷 冻按 D B 5 3/T 4 4 7.4 的 规 定 执 行。1 3 胚 胎 移 植按 D B 5 3/T 4 4 7.4 的 规 定 执 行。DB53/T 4 4 7.5 2 0 2 2
