1、Technical regulation for detection of Elsinoe leucospila茶白星病原菌检测技术规程发 布 湖南省市场监督管理局 2022-05 发 布-0643湖南省地方标准ICSCCS 67.140.10B 35DB43/T2332 2022 2022-08 实 施-06DB43/T 2332 2022 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 4 样 品采 集 1 5 形 态检 测 2 6 分 子检 测 2 附录A（资 料性）茶白 星病的 田间 症状 4 附录B（资 料性）茶白 星病菌 的菌 落、菌丝 与孢
2、子形态 5 附录C（资 料性）茶白 星病菌 基因 序列 片段 6 参考文 献 7 DB43/T 2332 2022 II DB43/T 2332 2022 III 前 言 本文件 按 照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构和起 草规 则 的规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发 布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南省 农业 农村 标准化 技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：湖 南省 茶叶研 究所。本文件 主要 起草 人：周凌 云、杨 辉、杨文 波
3、、向芬、刘红 艳、李维、银 霞、曾泽萱。DB43/T 2332 2022 IV DB43/T 2332 2022 1 茶白星病 原菌检 测技术规 程 1 范围 本文件 规定 了茶 白星 病原 菌的术 语和 定义、样 品采 集、形 态检 测和 分子 检测。本文件 适用 于茶 白星 病菌-茶痂囊 腔菌（Elsinoe leucospila）的检 测。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修
4、改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 8302 茶 取样 SB/T 10314 1999 采样 方法及 检验 规则 NY/T 3862 茶 云纹 叶枯 病 监测技 术规 程 3 术 语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 样 品采 集 4.1 采样 特征 4.1.1 发 生部 位 茶白星 病症 状可 见 于02000 m 海拔 茶区 的茶 树嫩 梢、成 叶、老叶 与花 苞等 茶树组 织。4.1.2 初 期症 状 初期病 斑为 针尖 大小 的红 褐色小 点，随即 围绕 该点 出现多 个红 褐色 斑点 呈卫 星状分
5、布，斑点 直径 生长至 2.5 mm 大 小，红褐 色 圆形病 斑边 缘具 有暗 褐色 至紫褐 色隆 起线，中 间凹 陷、平 伏或 凸起。4.1.3 后 期症 状 发病后 期病 斑由 红褐 色渐 变为黑 褐色，边 缘凸 起，中间白 色，呈疮 痂状，病 斑呈数 个至 上百 个连 片分布，严重 时病 斑相 互融 合成不 规则 的大 病斑。大 病斑常 呈黑 色凸 起，中间 呈灰白 色（见附 录 A）。4.2 采样 采样量 不得 少于 检验 需要 量的三 倍。随 机选 取具 有 典型症 状的 茶枝，保湿 剪 切口后 样品 分装、贴标签（包 括来 源、地点、采 集人、日期 等信 息）。DB43/T 23
6、32 2022 2 5 形 态检 测 5.1 材料 与仪 器 培养皿、枪头、三 角瓶、玻璃棒、剪刀、解 剖刀、镊子、接种环、75 酒精、3次 氯酸 钠、移 液枪、酒 精灯、超 净工 作台、培养 箱、灭菌 锅、天平。5.2 病原 分离 选取有 发 病 组 织 的 样 品，用 无 菌 水 洗 净，从 叶 脉、茎 秆 或 叶 肉 等 组 织 的 病 健 交 界 处 切 取约 2 mm2 mm 小 块病 组织，于 75 乙醇 中 5 s、3 次氯 酸 钠溶液 中 110 s、无菌 水 中清 洗3 次、晾 干后 置于直径 9 cm 的PDA 培 养基（200 g 马 铃薯、20 g 葡萄 糖、20 g
7、琼 脂粉，蒸 馏水 定容至1 L）平板 上，再倒置于 恒温 培养 箱 中 24 下黑暗 培 养 7 d，待 菌落 长 出形成 孢子 后，用琼 脂平 板单孢 子挑 取法 进行 单孢分离。5.3 病原 菌落 茶白星 病的 病原 为痂 囊腔 属（Elsinoe）的 E.leucospila，属于 子囊 菌。单孢 分 离的菌 株，以 PDA 平板培养 基 在 24 恒 温培 养 箱中培 养至 稳定 期并 观察，该菌 生长 速度 很慢，60 d 至80 d 后 菌落 生长 至稳定期。菌落 初期 为黄 褐色，后期为 红褐 色，呈近 圆形 毡状，边缘 有褶 皱，边界 光 滑清晰，质 地致 密坚 硬，中心位
8、置丘 状凸 起，具粉 红色粘 稠状 分生 孢子 堆，后期菌 落边 缘较 薄，表面 有时产 生白 色菌 丝，并 分泌色素等 物质 使培 养基 呈黄 色或红 色等 颜色（见 附 录B-1）。5.4 分生 孢子 分生孢 子在 光学 或电 子显 微镜下 的形 态。成熟 菌落 的表面 有大 量分 生孢 子。光学或 电子 显微 镜下 观察，分 生孢 子单 胞，椭圆 形，半 透明，大 小为（2.0 6.5）m（1.0 2.5）m（见附 录 B-2）。6 分 子检 测 6.1 材料 与仪 器 真菌基 因组 DNA 提取 试剂 盒、琼 脂糖，核 酸染 料、TAE 电泳 缓冲 液、DNA 分子 量标准、PCR 仪
9、、恒温培养 箱、离心 机、天平、高压灭 菌器、恒 温水 浴锅、pH 计、电 泳分 析系 统，实 验室用 水符 合 GB/T 6682规定的 要求。6.2 引物 序列 表1 茶白 星病 病原PCR 检测引 物 目标基因 引物名称 序列（5-3）扩增产物 长度 ITS ITS-F TCCGTAGGTGAACCTGCGG 575 bp ITS-R TCCTCCGCTTATTGATATGCC LSU LROR GTACCCGCTGAACTTAAGC 915 bp LR5 ATCCTGAGGGAAACTTC RPB2 5F GAYGAYMGWGATCAYTTYGG 1001 bp 7CR CCCATRG
10、CTTGYTTRCCCAT 注：ITS 是内源转录间隔区(internally transcribed spacer)，LSU 是核糖体大亚基（large subunit rRNA），RPB2是 RNA 聚合酶II 的第 2 大亚基(the second largest RNA polymerase subunit)的英文缩写。DB43/T 2332 2022 3 6.3 操作 步骤 取供试 菌株 菌 丝0.4 g 左 右，采 用真 菌基 因 组 DNA 抽提试 剂盒 提 取 DNA 模板。配 制 PCR 扩增 体系：Taq DNA 聚 合酶0.25 L(5 U/l)，dNTPs 0.4 L，
11、DNA 模板 1 L，应 用ITS、LSU 或RPB2 的引 物对：上下游 引物（10 mol/L）各 1 L，ddH2O 补足 至50 L。设定 反应 条件：94 预变 性4 min；94 变 性30 s，55 退火30 s，72 延 伸 90 s，共 35 个循 环，最 后 72 延 伸10 min，4保 存。电泳 检测：设置以 ddH2O 代替DNA 模板 的空白 对照，将 PCR 扩 增 产物用1.2 琼脂 糖凝 胶 电泳检 测，凝胶 经核 酸染 料染色后 用紫 外观 察仪 观察 并照相。6.4 结果 观察 以 DNA 分子 量标 准为 参照，供 检样 品 PCR 产 物电 泳 后出现
12、 预期 大小 的条 带，判定为 检测 阳性，否则为阴性，切 胶回 收目 的条 带 DNA，对PCR 产物 进行 核苷酸 序列 测定 和同 一性 分析（附 录C）。DB43/T 2332 2022 4 附 录 A（资料 性）茶白星 病的 田间 症状 a,c：早期病斑；b,d：晚期病 斑；e：叶脉病斑；f,g 茎秆病 斑；h.花苞病斑（c,d,g 光学 显微观察，标尺 2 mm）DB43/T 2332 2022 5 附 录 B（资料 性）茶白星 病菌 的菌 落、菌丝 与孢子 形态 附录B-1 茶白 星病 菌菌 落形态 a：PDA 培养基上培 养 10 d 的 菌落，b：PDA 上生长30 d 的
13、菌落，c：生长于 PDA 达 60 d 的菌落，d：生长在 PDA 上80 d 的菌落 附录B-2 茶白 星病 菌显 微形态 a：茶叶病斑组织，b：发病茶 叶组织中病菌菌丝簇，c：PDA 培养基上生长的病菌菌丝簇，d，e，f：病菌分生孢子（a-d 光学显微观察，标尺 10 m；e 和f 扫描电子显微镜观 察）DB43/T 2332 2022 6 附 录 C（资料 性）茶白星 病菌 基因 序列 片段 1.Elsinoe leucospila-ITS（NCBI 登录 号：MK312257）TGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGCCTCCTTCGGGAGCCCGAACTCCCCACC
14、CTTTGCTGTTGCGAACAAGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCTCCCCTTCAAAACGGGGGGGGGACCGGGCCTCTGCGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTGTTAAAACAATGCAGTCGGAGTACAATCGTACAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGT
15、TCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGTCTAGGCCGGACCCCCGCGTCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCGAAACGTCAGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTCAAACCTTTACATTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC 2.Elsinoe leucospila-LSU（NCBI 登录 号：MK793761）GCTGCGGGAGAGAGCAACAGGGATTGCCTCAGTAAC
16、GGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGCGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTATTGGGTTGCCACCGGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTATGTGACCGGCCAGGCGCCTTTTGTATAGCTCCTTCGACGAGTCGGGTTGTTTGGGAATGCAGCCCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAG
17、AGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAATCAGTCTCGACGGCGGCTGTTCGGCCTCTCTTCTGAGTGGTTTATTCAGTCGCCGCCGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCCGGATAAAGGCGTGGGGAATGTAGCTCCCTCGGGAGTGTTATAGCCCCGCGTGCAATACGGCCCGCCGGGACTGAGGTCCGCGCTCCGGTTAGGATGCTGGCGAAATGGTTGTAAGCGGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATCTACGCGAGTGTTTGGGTGTCAAA
18、CCCATACGCGCAATGAAAGTGAACGGAGGTGGGAACCGCAAGGTGCACCATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATTTGGGTATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCCTGCCGAAGTCCCCCTCCAGGATAAGAAAAA 3.Elsinoe leucospila-
19、RPB2（NCBI 登 录号：MK814962）AAAAACCAAGGATTAGCCTGGGACTCTCATGTCTCAGTCTTCGTCTCAAGTTTACTCAGCTCGTCCGCGACATAAGAACTAACTATCACGCTGTGTCGAGCAGGGCAAAGACTTCAATTTGACTCTGGCTGTCAAGTCAAATATCATCACCAATGGTCTTCGATACTCGCTAGCCACTGGAAATTGGGGTGACCAAAAAAAGGCCTCATCAGCTCGAGCTGGAGTGTCTCAAGTGCTGAACCGCTTCACCTACGCTGCATGCCTTTCCCATCTGCG
20、ACGTACCAATACTCCGATTGGACGAGACGGCAAGATCGCCAAACCTCGTCAATTACACAACAGTCATTGGGGTCTTGTCTGCCCTGCTGAGACACCAGAAGGTCAGGCATGTGGCCTCGTCAAGAATCTTTCTCTGATGACTTACGTCTCCGTCGGTACACCTGCAAAGCCTATCGTTGAGTTCCTTGAGAACAGAGGGGTGGAAATCCTCGAAGAGTACGATCCCAAAACCAATCCGAATGCTACCAAGGTGTTTGTGAACGGTCAGTGGATCGGAGTGTCCAGAGACGCCCAAATCCT
21、ACACGAGACGATCCTTCACCTGCGACGACACAGGACGCTCTCTTTCGAAATCAGTCTGATCAGAGATGTCCGTGCTCGCGAGTTCCGCATCTTCACTGATTGCGGTCGTGTAATGAGACCTGTATTTGTGGTCAACAATGAGCCCGGTGAGGATCAGGGAAAGCTTTATTACAACCGGACACATGTGGACAGGCTTCAGGCAGACAACGACATCGATACTACAGGCGTCAGTGAGGAAGATCGAGATGATATTGTCTTTGGCTGGACTGGGCTGGTGCACAACGGTGTGGTGGAATACCTGGACGCTGACGAGGAGGAGATGACTATGATCGCAATGTCACCCGAGGACTTGGACGAGCATCGTGCGATGCGGCAAGGTCATACGATTGTCGAAGAATACTTCAGATCCCCATCGCCGCTTCAA DB43/T 2332 2022 7 参 考 文 献 1 HNZ 205 茶白 星病 监测与 绿色 防控 技术 规程 2 HNZ 256 茶白 星病 绿色防 控技 术规 程
