1、I C S 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 4 4 2201 长 春 市 地 方 标 准 D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 梅 花 鹿 胚 胎 移 植 技 术 规 范 T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r e m b r y o t r a n s f e r o f s i k a d e e r 2 0 2 2 - 0 1 - 14 发 布 2 0 2 2 - 0 1 - 3 0 实 施 长 春 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2
2、 I 前 言 本 文 件 按 照 G B / T 1 . 1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 : 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草 。 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 , 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。 本 文 件 由 长 春 市 农 业 农 村 局 提 出 并 归 口 。 本 文 件 起 草 单 位 : 长 春 市 农 业 科 学 院 、 长 春 市 乾 艺 生 物 科 技 研 究 院 、 长 春 市 颂 祥 牧 业 科 技 有 限 公 司 。 本 文 件 主
3、 要 起 草 人 : 田 来 明 、 崔 鹤 馨 、 权 心 娇 、 付 晓 霞 、 李 男 、 陈 琦 、 叶 飞 、 吕 文 发 、 魏 海 军 、 刘 磊 、 张 鸿 、 祝 春 玲 、 张 事 铭 、 吕 铁 峰 、 沈 金 龙 。D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 2 梅 花 鹿 胚 胎 移 植 技 术 规 范 1 范 围 本 文 件 规 定 了 胚 胎 移 植 的 基 本 要 求 、 前 期 准 备 、 胚 胎 移 植 、 妊 娠 检 查 和 记 录 的 要 求 。 本 文 件 适 用 于 梅 花 鹿 胚 胎 生 产 和 移 植 技 术 操 作 。 2 规 范
4、性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 , 注 日 期 的 引 用 文 件 , 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ; 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本 ( 包 括 所 有 的 修 改 单 ) 适 用 于 本 文 件 。 D B 2 2 / T 2 6 1 1 - 2 0 1 7 梅 花 鹿 冷 冻 精 液 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。 3 . 1 胚 胎 移 植 e m b r
5、y o t r a n s f e r 将 良 种 母 鹿 体 内 早 期 胚 胎 或 体 外 受 精 及 其 他 方 式 获 得 的 早 期 胚 胎 , 移 植 到 同 种 生 理 状 态 相 同 的 受 体 母 鹿 体 内 , 使 之 继 续 发 育 成 个 体 的 技 术 。 3 . 2 供 体 鹿 d o n o r 在 胚 胎 移 植 过 程 中 提 供 胚 胎 的 母 鹿 。 3 . 3 受 体 鹿 r e c i p i e n t 在 胚 胎 移 植 过 程 中 接 受 胚 胎 的 母 鹿 。 3 . 4 同 期 发 情 s y n c h r o n i z a t i o
6、n o f e s t r u s 利 用 某 些 激 素 制 剂 人 为 地 控 制 并 调 整 母 鹿 在 预 定 时 间 内 集 中 发 情 。 3 . 5 阴 道 栓 v a g i n a l s u p p o s i t o r y 一 种 内 含 孕 酮 、 用 特 制 的 放 置 器 将 其 放 入 阴 道 穹 隆 的 同 期 发 情 装 置 。 3 . 6 超 数 排 卵 m u l t i p l e o v u l a t i o n 在 母 鹿 发 情 周 期 的 适 当 时 间 , 应 用 外 源 促 性 腺 激 素 处 理 , 使 卵 巢 比 自 然 发 情 时
7、有 更 多 的 卵 泡 发 育 并 排 卵 , 简 称 为 “ 超 排 ” 。 3 . 7 人 工 授 精 a r t i f i c i a l i n s e m i n a t i o nD B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 3 用 人 工 方 法 适 时 将 精 液 输 入 发 情 母 鹿 宫 颈 内 达 到 受 孕 , 以 代 替 公 母 鹿 交 配 而 繁 衍 后 代 的 一 种 繁 殖 方 法 。 3 . 8 冷 冻 精 液 f r o z e n s e m e n 鲜 精 液 经 人 工 处 理 后 在 液 氮 中 (-196 ) 冷 冻 保 存 的 精 液
8、 。 4 基 本 要 求 4 . 1 供 体 和 受 体 母 鹿 应 为 同 一 属 种 。 4 . 2 供 体 鹿 和 受 体 鹿 发 情 时 间 相 差 不 应 超 过 2 4 h 。 4 . 3 从 供 体 鹿 输 卵 管 内 收 集 到 的 胚 胎 应 移 植 到 受 体 鹿 的 输 卵 管 内 , 从 供 体 鹿 子 宫 角 内 收 集 到 的 胚 胎 应 移 植 到 受 体 鹿 的 子 宫 角 内 。 4 . 4 胚 胎 发 育 应 处 于 周 期 黄 体 期 内 。 4 . 5 供 体 鹿 和 受 体 鹿 的 比 例 应 为 1 : 5 1 : 6 。 5 前 期 准 备 5 .
9、 1 供 体 鹿 和 受 体 鹿 选 择 5 . 1 . 1 供 体 鹿 选 择 5 . 1 . 1 . 1 品 种 优 良 , 生 产 性 能 好 。 5 . 1 . 1 . 2 遗 传 性 能 稳 定 , 谱 系 完 整 。 5 . 1 . 1 . 3 体 质 健 壮 , 无 遗 传 疾 病 、 生 殖 疾 病 和 传 染 性 疾 病 。 5 . 1 . 1 . 4 产 历 清 楚 , 无 流 产 史 , 性 周 期 正 常 , 繁 殖 机 能 好 的 适 龄 成 年 母 鹿 。 5 . 1 . 2 受 体 鹿 选 择 5 . 1 . 2 . 1 健 康 、 营 养 状 况 良 好 , 无
10、 遗 传 疾 病 、 生 殖 疾 病 和 传 染 性 疾 病 。 5 . 1 . 2 . 2 繁 殖 性 能 良 好 , 发 情 周 期 正 常 , 母 性 和 哺 乳 能 力 良 好 , 无 流 产 史 , 产 后 6 0 d 以 上 的 经 产 母 鹿 。 5 . 2 同 期 发 情 5 . 2 . 1 供 体 鹿 空 怀 母 鹿 在 任 意 一 天 放 入 含 有 孕 激 素 的 阴 道 栓 , 1 2 d 后 撤 掉 , 同 时 肌 肉 注 射 孕 马 血 清 促 性 腺 激 素 ( P M S G ) 3 0 0 I U 3 5 0 I U 。 5 . 2 . 2 受 体 鹿 5 .
11、 2 . 2 . 1 空 怀 母 鹿 同 期 处 理 之 前 应 进 行 直 肠 触 摸 或 超 声 波 检 查 , 检 查 卵 巢 是 否 有 周 期 性 黄 体 。 5 . 2 . 2 . 2 操 作 步 骤 同 5 . 2 . 1 。 5 . 2 . 2 . 3 同 期 发 情 处 理 后 , 密 切 观 察 , 通 过 直 肠 触 摸 或 超 声 波 检 查 卵 泡 发 育 状 态 , 观 察 发 情 。D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 4 5 . 2 . 3 发 情 鉴 定 阴 道 栓 取 出 后 1 2 h 开 始 用 试 情 公 鹿 每 隔 2 h 4 h
12、试 情 一 次 , 每 次 持 续 0 . 5 h 1 h 。 母 鹿 稳 定 接 受 爬 跨 即 为 发 情 。 记 录 母 鹿 接 受 爬 跨 的 时 间 。 5 . 3 供 体 鹿 超 数 排 卵 放 置 阴 道 栓 当 天 记 为 第 0 d , 放 阴 道 栓 第 9 d 开 始 注 射 促 卵 泡 素 ( F S H ) , 每 天 注 射 两 次 间 隔 1 2 h , 早 晚 各 1 次 , 4 天 8 次 减 量 注 射 。 到 第 1 2 d 1 3 d 结 束 , 共 注 射 3 2 0 m g F S H 。 第 7 次 注 射 F S H 时 取 出 阴 道 栓 。
13、5 . 4 人 工 授 精 5 . 4 . 1 冷 冻 精 液 品 质 应 符 合 D B 2 2 / T 2 6 1 1 的 规 定 。 5 . 4 . 2 操 作 步 骤 5 . 4 . 2 . 1 精 液 准 备 : 细 管 冻 精 空 气 浴 后 , 应 用 3 8 2 温 水 直 接 浸 泡 解 冻 , 不 超 过 1 0 m i n ; 5 . 4 . 2 . 2 确 认 母 鹿 发 情 接 受 爬 跨 后 , 进 行 输 精 ; 5 . 4 . 2 . 3 保 定 母 鹿 , 外 阴 应 清 洗 消 毒 ; 5 . 4 . 2 . 4 把 精 液 装 入 无 胶 塞 注 射 器
14、, 并 连 接 输 精 管 , 排 出 空 气 , 冻 精 的 剂 量 为 2 支 / 头 ; 5 . 4 . 2 . 5 抹 无 菌 润 滑 剂 , 手 持 输 精 管 缓 慢 插 入 母 鹿 阴 道 内 , 小 心 通 过 子 宫 颈 插 入 子 宫 体 , 推 入 精 液 , 将 输 精 管 缓 慢 退 出 , 完 成 输 精 。 6 胚 胎 移 植 6 . 1 手 术 冲 胚 6 . 1 . 1 时 间 应 在 供 体 母 鹿 第 一 次 配 种 后 6 d 7 d 。 6 . 1 . 2 器 材 冲 胚 管 及 内 芯 、 钝 性 9 # 或 1 2 # 针 头 、 止 血 钳 、
15、注 射 器 、 培 养 皿 、 量 筒 、 毛 剪 、 镊 子 、 手 术 刀 、 手 术 缝 合 针 和 缝 合 线 、 创 布 、 止 血 纱 布 、 体 式 显 微 镜 、 恒 温 板 等 。 6 . 1 . 3 药 品 新 洁 尔 灭 、 0 . 9 % 生 理 盐 水 、 胚 胎 保 存 液 ( H o l d i n g 液 ) 、 酒 精 、 碘 伏 、 青 霉 素 、 链 霉 素 、 石 蜡 油 、 麻 醉 药 、 解 麻 药 等 。 6 . 1 . 4 冲 胚 液 的 配 置 杜 氏 磷 酸 盐 缓 冲 液 ( P B S ) , 配 方 参 见 附 录 A 。 或 者 使
16、用 商 品 冲 胚 液 。 6 . 1 . 5 步 骤D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 5 6 . 1 . 5 . 1 供 体 母 鹿 应 在 术 前 2 4 h 内 禁 食 禁 水 , 手 术 在 冲 胚 室 进 行 。 6 . 1 . 5 . 2 供 体 母 鹿 应 进 行 全 身 麻 醉 , 呈 前 低 后 高 仰 卧 保 定 。 6 . 1 . 5 . 3 麻 醉 后 的 母 鹿 应 进 行 术 部 备 皮 , 用 温 水 清 洗 , 5 % 碘 酊 和 7 5 % 酒 精 消 毒 。 6 . 1 . 5 . 4 在 腹 部 中 线 距 乳 房 约 4 c m 处
17、 做 一 切 口 , 将 两 侧 子 宫 角 和 输 卵 管 暴 露 , 观 察 左 右 卵 巢 上 的 黄 体 发 育 情 况 并 记 录 。 6 . 1 . 5 . 5 在 子 宫 角 大 弯 处 钝 性 穿 孔 约 2 m m , 插 入 冲 胚 管 , 由 充 气 管 注 入 5 m L 左 右 空 气 , 使 气 囊 封 阻 子 宫 腔 ; 输 卵 管 近 子 宫 端 用 带 胶 管 的 止 血 钳 做 封 闭 , 在 子 宫 角 和 输 卵 管 结 合 部 的 子 宫 角 端 插 入 钝 性 9 # 或 1 2 # 针 头 作 为 接 胚 管 , 将 1 0 m L 3 0 m L
18、 冲 胚 液 ( 3 5 3 7 ) 缓 慢 注 入 冲 胚 管 , 同 时 接 收 胚 胎 , 收 集 于 培 养 皿 ( 直 径 9 0 m m ) 中 , 放 气 后 取 下 冲 胚 管 。 6 . 1 . 5 . 6 将 子 宫 角 放 回 体 内 , 并 用 0 . 9 % 的 生 理 盐 水 进 行 冲 洗 , 并 注 入 2 m L 石 蜡 油 以 防 止 生 殖 道 连 。 6 . 1 . 5 . 7 缝 合 伤 口 , 撒 抗 生 素 ( 青 霉 素 和 链 霉 素 ) , 并 在 术 后 的 3 d 内 每 天 注 射 2 次 青 霉 素 ( 8 0 0 0 0 0 0 I
19、 U / 次 ) 。 6 . 2 胚 胎 6 . 2 . 1 胚 胎 质 量 鉴 定 6 . 2 . 1 . 1 检 胚 在 实 验 室 ( 检 胚 室 ) 内 2 0 2 5 常 温 下 , 将 冲 胚 后 回 收 液 平 皿 放 在 3 0 的 恒 温 板 上 , 置 于 体 式 显 微 镜 下 , 划 分 区 域 , 按 从 左 到 右 、 从 上 到 下 的 “ Z ” 路 线 进 行 检 查 。 检 出 的 胚 胎 用 吸 卵 器 及 时 移 入 P B S 中 进 行 鉴 定 , 确 定 受 精 与 否 及 胚 胎 发 育 阶 段 。 6 . 2 . 1 . 2 分 级 6 . 2
20、 . 1 . 1 配 种 后 6 d 7 d 的 供 体 鹿 , 处 于 以 下 发 育 期 : 桑 椹 胚 ( M ) 、 致 密 桑 椹 胚 ( C M ) 、 早 期 囊 胚 ( E B ) 、 囊 胚 ( B ) 或 扩 张 囊 胚 ( E X B ) 。 6 . 2 . 1 . 2 按 形 态 学 将 胚 胎 划 分 为 1 、 2 、 3 、 4 四 个 等 级 , 1 、 2 级 胚 胎 为 可 用 胚 胎 , 3 、 4 级 为 不 可 用 胚 胎 。 a ) 1 级 : 发 育 正 常 , 胚 龄 与 发 育 期 一 致 , 胚 胎 细 胞 团 成 均 匀 对 称 的 球 形
21、 , 轮 廓 清 晰 , 分 裂 球 大 小 均 匀 , 结 构 紧 凑 , 色 调 和 透 明 度 适 中 , 无 游 离 的 细 胞 和 液 泡 , 或 很 少 , 变 性 细 胞 比 例 少 于 1 0 % ; b ) 2 级 : 胚 龄 与 发 育 期 基 本 一 致 , 轮 廓 清 晰 , 分 裂 球 大 小 基 本 一 致 , 色 调 和 透 明 度 及 细 胞 密 度 良 好 , 可 见 到 一 些 游 离 的 细 胞 和 液 泡 , 变 性 细 胞 占 1 0 % 3 0 % ; c ) 3 级 : 胚 龄 与 发 育 期 不 太 一 致 , 轮 廓 不 清 晰 , 色 调 过
22、 暗 或 过 淡 , 细 胞 密 度 小 , 结 构 较 松 散 , 游 离 的 细 胞 或 液 泡 较 多 , 变 性 细 胞 达 3 0 % 5 0 % ; d ) 4 级 : 发 育 阶 段 迟 缓 、 细 胞 不 均 匀 、 变 性 细 胞 占 胚 胎 大 部 分 ; 未 受 精 卵 。 6 . 2 . 2 冷 冻 保 存 和 解 冻 6 . 2 . 2 . 1 冷 冻 保 存 6 . 2 . 2 . 1 . 1 器 具 实 体 显 微 镜 、 胚 胎 冷 冻 仪 、 液 氮 罐 、 细 管 、 胚 胎 吸 管 、 0 . 2 2 m 过 滤 器 、 培 养 皿 、 记 号 笔 等 。
23、 6 . 2 . 2 . 1 . 2 保 存 液 与 冷 冻 液D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 6 保 存 液 : 含 有 2 0 % 犊 牛 血 清 ( C S ) 的 P B S 液 。 冷 冻 液 : 8 % 乙 二 醇 ( E G ) 0 . 1 m o l / L 海 藻 糖 ( T r e . ) m - P B S 2 0 % C S , 用 0 . 2 2 m 滤 器 过 滤 灭 菌 分 装 。 6 . 2 . 2 . 1 . 3 胚 胎 装 管 胚 胎 应 在 保 存 液 微 滴 中 清 洗 4 次 , 后 在 冷 冻 液 微 滴 中 清 洗 4 次
24、。 将 胚 胎 吸 入 0 . 2 5 m L 细 管 内 , 用 封 口 机 封 口 、 分 类 、 标 记 , 在 4 的 冰 箱 内 放 置 平 衡 1 0 m i n 1 5 m i n 后 放 入 冷 冻 仪 。 6 . 2 . 2 . 1 . 4 胚 胎 冷 冻 保 存 胚 胎 冷 冻 仪 温 度 调 至 - 6 - 7 , 保 持 2 m i n 后 进 行 人 工 植 冰 , 继 续 保 持 至 1 0 m i n , 以 0 . 3 / m i n 的 速 率 降 温 至 - 3 5 - 3 8 , 保 持 1 0 m i n 后 , 直 接 放 入 液 氮 罐 中 保 存
25、, 并 定 期 检 查 和 加 液 氮 。 6 . 2 . 2 . 2 解 冻 从 液 氮 中 取 出 装 有 胚 胎 的 细 管 , 空 气 浴 1 0 s 后 3 2 3 5 水 浴 1 0 s , 用 消 毒 纸 擦 干 细 管 , 再 用 半 干 的 酒 精 棉 球 擦 拭 细 管 表 面 , 晾 干 , 剪 开 细 管 封 口 端 ( 如 用 细 管 塞 封 口 的 则 拔 出 即 可 ) , 细 管 棉 塞 端 朝 里 装 入 移 植 枪 供 移 植 。 应 在 解 冻 后 1 0 m i n 内 完 成 移 植 。 6 . 3 移 植 6 . 3 . 1 器 具 手 术 刀 、
26、手 术 缝 合 针 和 缝 合 线 、 腹 腔 内 窥 镜 、 宫 颈 钳 、 钝 性 9 # 针 头 、 移 胚 针 等 。 6 . 3 . 2 药 品 胚 胎 保 存 液 ( H o l d i n g 液 ) 、 5 % 碘 酊 、 黄 体 酮 、 青 霉 素 和 链 霉 素 等 。 6 . 3 . 3 步 骤 6 . 3 . 3 . 1 受 体 鹿 术 前 准 备 同 6 . 1 . 5 . 1 、 6 . 1 . 5 . 2 和 6 . 1 . 5 . 3 的 处 理 方 法 。 6 . 3 . 3 . 2 在 乳 房 前 方 腹 中 线 两 侧 各 切 开 一 个 0 . 5 c
27、m 1 c m 长 的 小 口 , 一 侧 插 入 打 孔 器 和 腹 腔 镜 , 另 一 侧 插 入 宫 颈 钳 。 通 过 腹 腔 镜 和 宫 颈 钳 相 互 配 合 观 察 受 体 鹿 的 卵 巢 状 态 , 记 录 黄 体 数 目 。 6 . 3 . 3 . 3 将 卵 巢 上 有 1 3 个 黄 体 侧 的 子 宫 角 取 出 , 在 子 宫 角 的 上 1 / 3 部 位 用 钝 性 9 # 针 头 穿 刺 , 用 移 胚 针 在 穿 孔 处 移 胚 。 6 . 3 . 3 . 4 受 体 鹿 创 口 各 缝 1 针 , 外 涂 5 % 碘 酊 。 7 妊 娠 检 查 应 在 移
28、植 结 束 后 9 0 d 采 用 超 声 波 法 检 查 , 确 认 母 鹿 是 否 怀 孕 以 及 胎 儿 发 育 情 况 。 8 记 录 胚 胎 移 植 过 程 中 应 记 录 供 体 鹿 超 数 排 卵 、 输 精 、 冲 胚 、 受 体 鹿 移 植 情 况 , 记 录 内 容 可 参 考 附 录 B 。D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 7 A A 附 录 A ( 资 料 性 ) 杜 氏 磷 酸 盐 缓 冲 液 ( P B S ) 配 方 杜 氏 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS ) 配 方 见 表 A . 1 。 表 A . 1 杜 氏 磷 酸 盐 缓 冲 液
29、( P B S ) 配 方 表 成分 剂量(g / L ) N a C l 8 . 0 0 K C l 0 . 2 0 N a 2 H P O 4 ( N a 2 H P O 4 1 2 H 2 ) 1 . 5 (2 . 9 1 6 ) C a C l 2 ( C a C l 2 2 H 2 O ) 0 . 1 0 (0 . 1 3 2 ) K H 2 P O 4 0 . 2 0 M g C l 2 ( M g C l 2 6 H 2 O ) 0 . 1 0 (0 . 2 1 3 3 ) 丙酮酸钠 0 . 3 6 g 葡萄糖(葡萄糖H 2 O ) 1 . 0 0 ( 1 . 1 0 ) g 青
30、霉素 0 . 0 7 5 g 链霉素 0 . 0 5 g 注1 :配制 P B S 的所用药品必须是分析纯以上的化学试剂。也可使用进口成品 P B S 粉剂,详见产品使用说明书。 注2 :配用 P B S 所用水是阻值超过1 8 M 的超纯水。 注3 :配好的冲卵液需灭菌, p H 为7 . 2 7 . 6 ,渗透压为2 7 0 m O s 2 9 0 m O s , 4 低温保存。D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 8 B B 附 录 B ( 资 料 性 ) 梅 花 鹿 胚 胎 移 植 记 录 B . 1 梅 花 鹿 胚 胎 移 植 前 期 记 录 梅 花 鹿 胚 胎 移
31、 植 前 期 记 录 见 表 B . 1 。 表 B . 1 梅 花 鹿 胚 胎 移 植 前 期 记 录 养殖场: 供体号: 品种: 出生时间(年龄) : 断奶时间: 胎次: 发情状况: 同 期 发 情 阴道栓: 批号: 总剂量: 放栓时间: 撤栓时间: 促排药: 注射时间: 剂量: 发情时间: 发情表现: 超 排 处 理 激素: 批号: 总剂量: 第一天 早: 第二天 早: 晚: 晚: 第三天 早: 第四天 早: 晚: 晚: 第五天 早: 第六天 早: 晚: 晚: 人 工 授 精 耳号 精液品质 授精时间 第1 次: 第2 次: 第3 次:D B 2 2 0 1 / T 2 0 2 0 2 2 9 B . 2 供 体 鹿 冲 胚 记 录 供 体 鹿 冲 胚 记 录 见 表 B . 2 。 表 B . 2 供 体 鹿 冲 胚 记 录 供体号 胎次 冲胚时间 胚胎总数 可用胚胎数 卵巢 回收率 卵巢 回收 卵数 未受 精卵 退化 卵数 胚胎发育等级 黄体数 卵泡数 胚胎数 等级 桑椹胚 囊胚 左 A B C D 右 A B C D B . 3 受 体 鹿 移 植 记 录 受 体 鹿 移 植 记 录 见 表 B . 3 。 表 B . 3 受 体 鹿 移 植 记 录 序号 受体号 移植时间 黄体数 移植胚胎数 胚胎等级 供体号 备注 左 右 左 右