1、ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53372021 动物疫病传播媒介蜱种类 鉴定技术规范 Quarantine protocol for species identification for tick vectors transmitting animal diseases 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照G B / T 1 . 1 2 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中国检验检
2、疫科学研究院、中华人民共和国温州海关、中华人民共和国上海海关。 本文件主要起草人:吕继洲、王素华、吴绍强、李树清、林祥梅、袁向芬、王慧煜、邓俊花、王彩霞。 SN/T53372021 动物疫病传播媒介蜱种类 鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了动物疫病传播媒介蜱的采集、保存、形态学鉴定以及D N A条形码鉴定方法。 本文件适用于动物疫病传播媒介蜱的种类鉴定,可辅助应用于相关动物疫病的监测与防控。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本
3、文件。 G B / T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 C O I :细胞色素c氧化酶亚基I ( C y t o c h r o m e c o x i d a s e s u b u n i t I ) ; D N A :脱氧核糖核酸( D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ) ; d N T P :脱氧核糖核苷三磷酸( D e o x y - r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e )
4、 ; P C R :聚合酶链式反应( P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) ; S D S :十二烷基硫酸钠( S o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ) 5 样品采集 5.1 试剂与材料 5.1.1 干冰。 5.1.2 乙醚(或松节油、煤油、三氯甲烷等) 。 5.1.3 无水乙醇。 5.1.4 橡胶手套。 5.1.5 5 0 m L离心管与1 5 m L 离心管。 5.1.6 白绒布(长5 0 c m 1 0 0 c m ,宽2 5 c m 1 0 0 c m ) 。 5.1.7 离心管。 5.
5、1.8 吸水纸。 1 SN/T53372021 5.2 设备与仪器 5.2.1 聚苯乙烯塑料杯( 5 0 0 m L ) 。 5.2.2 不锈钢诱捕装置( 3 0 c m 4 5 c m 8 c m ) 。 5.2.3 真空吸尘器。 5.3 采集方法 5.3.1 防护要求 5.3.1.1 应穿浅色、表面光滑实验服,扎紧裤腿或把裤腿塞进鞋袜里,穿靴子,戴橡胶手套。 5.3.1.2 裸露皮肤应涂抹趋避剂如避蚊胺等。 5.3.1.3 帐篷等露营装备应用杀虫剂浸泡。 5.3.1.4 避免在蜱栖息地如草地、树林等环境中长时间坐卧。 5.3.1.5 野外活动结束后应检查衣物上是否有蜱,一旦发生蜱叮咬,不可
6、用手强行拔除,应用乙醚等处 理蜱使其自行从身上脱落,尽快就医。 5.3.2 畜禽体上蜱的采集 在牛、羊、犬、禽等动物身上采集蜱,动物身下铺放白布。用准备好的乙醚(或松节油、煤油、三氯甲 烷)涂抹蜱头部,等待数分钟,蜱自行从动物身上脱落。用镊子摘取脱落蜱,放置到离心管中。 5.3.3 周围环境中蜱的采集 在经常放牧的草地、野生动物巢穴、家养畜舍地面及墙缝内采集蜱。方法如下: a ) 手工采集法:通过手工挖开野生动物巢穴、家养畜舍居住地里缝隙或洞穴中的泥土,通过肉眼 观察,用镊子采集蜱。 b ) 二氧化碳诱捕法:使用不锈钢装置,放置一个装满干冰的聚苯乙烯塑料杯( 5 0 0 m L ) 。不锈钢
7、装置放置于蜱出入区域的地面,用泥土将诱捕器的表面覆盖,人即离开,在几个小时或过夜后 回来收集蜱。 c ) 真空吸尘法:在野外大批量收集蜱时,用真空吸尘器在圈舍、草地或灌木丛中吸取样品,检查真 空吸尘器桶体,用镊子夹取蜱收集于离心管中。 d ) 布旗法:白绒布一边穿入木棍,在木棍两端系以长绳,在草地上或灌木从中拖动,草地以及灌 木上的蜱即可附着在旗面上,检查并用镊子收集于离心管中。 5.4 样品运输及保存 5.4.1 将采集的活蜱放入1 5 m L或5 0 m L 离心管中,管中宜放置浸水的吸水纸、棉花等,常温运输, 2 4 h内送入实验室。容器上应附有采集标签,注明采集地点、日期、宿主、生境、
8、海拔、经纬度、采集人等 信息。 5.4.2 活蜱先放入7 0 8 0 热水中杀死,用吸水纸吸干体表水分,放入1 . 5 m L离心管中,放置在 - 8 0 冰箱保存。 6 形态学鉴定 6.1 试剂与材料 6.1.1 灭菌双蒸水(应符合G B / T 6 6 8 2 中一级水的规格,按照 A . 8配制) 。 2 SN/T53372021 6.1.2 无水乙醇。 6.1.3 手套。 6.1.4 吸水纸。 6.2 设备与仪器 体视显微镜。 6.3 形态学观察 6.3.1 未经- 8 0 保存的蜱,直接放置在体视显微镜下观察。 6.3.2 - 8 0 保存的蜱,可放在常温双蒸水中浸泡1 5 m i
9、n后,吸水纸吸干体表水分后观察。 6.3.3 观察蜱的背面观、腹面观、假头基、须肢、肛沟等,再观察气门板、生殖孔、哈氏器等形态学特征部 位。蜱具体形态特征部位参见附录B 。 6.4 蜱的形态学种类判定 6.4.1 蜱可鉴定到属,具体按照附录C鉴定。 6.4.2 蜱可根据典型形态特征鉴定到种,具体形态特征按照附录D鉴定,其他种蜱则需采用分子生物 学方法进行种类的鉴定。 7 DNA条形码鉴定 7.1 试剂与材料 除特别说明以外,本文件所用试剂均为分析纯,试验用水应符合规范性引用文件的规定。 7.1.1 无水乙醇。 7.1.2 蛋白酶K ( 2 0 m m o l / L ) 。 7.1.3 5 0
10、 T A E缓冲液(试剂配制按照A . 1 ) 。 7.1.4 阳性对照(长角血蜱的基因组D N A ,按照A . 2 ) 。 7.1.5 T i r s - H c l缓冲液(试剂配制按照A . 3 ) 。 7.1.6 生理盐水(试剂配制按照A . 4 ) 。 7.1.7 E D T A溶液(试剂配制按照A . 5 ) 。 7.1.8 T E S缓冲液(试剂配制按照A . 6 ) 。 7.1.9 1 0 % S D S溶液(试剂配制按照A . 7 ) 。 7.1.10 氯化钠。 7.1.11 三氯甲烷。 7.1.12 异丙醇。 7.1.13 冰乙酸。 7.1.14 T r i s 饱和酚。
11、7.1.15 7 0 %乙醇。 7.1.16 G o l d v i e w 核酸染料。 7.1.17 Taq D N A聚合酶。 7.1.18 d N T P ( 2 . 5 m m o l / L ) 。 7.1.19 琼脂糖。 7.1.20 灭菌双蒸水(应符合G B / T 6 6 8 2 中一级水的规格,按照 A . 8配制) 。 7.1.21 引物。 3 SN/T53372021 L C O 1 4 9 0 : 5 - G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T G G - 3 H C O 2 1 9 8 : 5 - T A A A C
12、 T T C A G G G T G A C C A A A A A A T C A - 3 用双蒸水将引物稀释为2 0 m o l / L工作浓度, - 2 0 保存备用。预期扩增片段长度为6 7 0 b p ,引 物合成后采用灭菌双蒸水稀释为1 0 m o l / L 。 7.2 设备与仪器 7.2.1 常规 P C R仪。 7.2.2 组织研磨器。 7.2.3 超净工作台。 7.2.4 制冰机。 7.2.5 高速冷冻离心机。 7.2.6 水浴锅。 7.2.7 台式小型离心机。 7.2.8 常规冰箱。 7.2.9 旋涡振荡器。 7.2.10 电泳仪。 7.2.11 凝胶成像系统。 7.2.
13、12 微量可调移液器( 1 0 L 、 1 0 0 L 、 1 0 0 0 L )及配套吸头。 7.3 检测方法 7.3.1 DNA提取 使用完整或不完整的成年蜱、幼蜱、若蜱、蜱卵样品。蜱样品用双蒸水冲洗后,用液氮冻后研磨,提 取待检组织基因组D N A ,按照附录E提取组织D N A的方法,也可采用商品化的组织基因组D N A提取 试剂盒进行。 7.3.2 PCR反应体系 在P C R管内,加入1 0 P C R缓冲液2 . 5 L , 5 U / L Taq D N A聚合酶0 . 5 L , 1 0 m o l / L上下游 引物各0 . 5 L , 1 0 m m o l / L d
14、N T P s 2 L ,模板D N A 2 L ,补充灭菌双蒸水至2 5 L 。 7.3.3 PCR扩增程序 9 5 预变性5 m i n ;之后9 5 变性3 0 s , 5 0 退火3 0 s , 7 2 延伸1 m i n ,共4 0个循环;最后7 2 延伸1 0 m i n 。 P C R阳性对照:取- 8 0 保存蜱基因组D N A 。 P C R阴性对照:加水替代基因组D N A 。 7.3.4 琼脂糖凝胶电泳 取5 L样品P C R扩增产物,进行1 % 2 %的琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后,用凝胶成像仪或者紫 外透射仪观察结果。 7.3.5 结果判定 7.3.5.1 阳性对照有6
15、 7 0 b p的扩增条带,同时阴性对照没有相应条带,判定试验成立;否则试验无效, 需分析并排除引起试验无效的因素,并重新试验。 4 SN/T53372021 7.3.5.2 在阳性、阴性对照都成立的前提下,若检测样品有6 7 0 b p的条带,则试验阳性;若检测样品无 6 7 0 b p条带,则试验阴性。 7.3.5.3 对试验成立且有6 7 0 b p阳性条带的样品,进行测序。 7.3.5.4 将P C R扩增后测序的C O I序列与条形码系统B O L D S Y S T E M中数据库中序列进行比对,排 位第一的序列为蜱序列,且序列相似度 9 7 % ,可判定蜱种。 8 结果综合判定
16、8.1 根据典型形态特征能够鉴定到种的样品,直接判定蜱种。 8.2 对于本身缺乏典型形态特征或部分典型特征的样品,应结合分子生物学D N A条形码方法结果进 行蜱种鉴定。 5 SN/T53372021 附 录 A (规范性) 试剂的配制 A.1 50TAE电泳缓冲液 T r i s 2 4 2 . 0 g N a 2 E D T A 2 H 2 O 3 7 . 2 g 冰乙酸5 7 . 1 m L 双蒸水定容至1 0 0 0 m L 充分溶解,室温保存 A.2 阳性对照 取蜱(成虫、若虫、幼虫、卵)等,应用本文件7 . 3中D N A提取方法或商品化D N A提取试剂盒,提取 基因组D N A
17、 ,使用5 0 L 灭菌双蒸水溶解或洗脱基因组D N A , - 8 0 保存。 A.3 1 mol/L Tris-HCl缓冲液(ph=8.0) 4 0 m L双蒸水, 6 . 0 5 7 g固体T r i s放入烧杯中溶解,用浓盐酸调p h值到8 . 0 ,转移到5 0 m L容量瓶 中,加入双蒸水定容,摇匀后,转到准备好的溶液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温, 4 保存备用。 A.4 0.85% NaCl溶液(生理盐水) 在2 0 m L双蒸水中溶解0 . 8 5 g固体N a C l ,加水定容至1 0 0 m L ,摇匀后,转到准备好的输液瓶中, 贴上标签,高压灭菌后,降至室温,
18、4 保存备用。 A.5 0.5 mol/L EDTA溶液(ph=8.0) 将9 . 0 8 g的N a 2 E D T A 2 H 2 O溶解于4 0 m L双蒸水,用1 g的N a O H颗粒(慢慢逐步加入)调p h 值到8 . 0 ,用5 0 m L容量瓶定容,如果E D T A难溶,先加N a O H溶解,然后逐步加N a 2 E D T A 2 H 2 O 。 A.6 TES缓冲液 将0 . 5 8 4 4 g的N a C l溶解于8 0 m L双蒸水,在分别加入1 m L的0 . 5 m o l / l E D T A 、 0 . 2 m L的 T r i s - H C l ( p
19、 H = 8 . 0 ) ,加定容至1 0 0 m L , 摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至 室温, 4 保存备用。 A.7 10% SDS 溶液 将1 0 g的十二烷基硫酸钠( S D S )溶解于8 0 m L双蒸水于6 8 加热溶解,用浓H C l调至P H = 7 . 2 ,定容至1 0 0 m L ,摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签, 4 保存备用。 A.8 灭菌双蒸水 双蒸水是重蒸水的一种,是将经过一次蒸馏后的水,再次蒸馏得到的水。双蒸水再经过高压蒸汽灭 菌(压力升至1 0 3 . 4 k P a ,温度达1 2 1 ,持续2 0 m i n ) ,得
20、到灭菌双蒸水。 6 SN/T53372021 A.9 酚三氯甲烷异戊醇 饱和酚( p H 8 . 0 ) 2 5 m L 三氯甲烷2 4 m L 异戊醇1 m L 使用前配制, 4 可保存2月。 7 SN/T53372021 附 录 B (资料性) 蜱基本信息及典型形态图谱 B.1 蜱隶属于节肢动物门( A r t h r o p o d a ) ,蛛形纲( A r a c h n i d a ) ,蜱螨亚纲( A c a r i n a ) 、寄螨目( P a r a s i t i - f o r m e s ) 、蜱总科( I x o d o i d e a ) ,包括硬蜱、软蜱及纳蜱三
21、类(见图B . 1 、 B . 2 ) 。 a) 背面观 b) 腹面观 图B.1 硬蜱(雄性成蜱) B.2 蜱背腹扁平,圆形或者椭圆形,身体分为假头和躯体两部分,假头突出于躯体前或者位于躯体腹 面前端,为口器部分。躯体腹部有4对足。蜱的躯体背腹面是否有几丁质的盾板及盾板形状等是鉴别 蜱种的重要特征。蜱的发育为不全变态,包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱四个阶段,幼蜱只有3对足。 B.3 蜱通常寄生在动物耳后、脚趾间、腋窝处以及颈项部等皮肤较薄、不易被搔动的部位,寄生数量多 时蜱在动物全身可见。 B.4 蜱是重要的吸血性外寄生虫,在蜕皮等发育时需要附着于宿主体表吸血。主要寄生在哺乳动物 体表,少数寄生在鸟
22、类、爬行类及两栖类体表。蜱在叮咬宿主、吸食血液的同时释放毒素,可导致瘫痪、 毒性反应以及宿主的过敏反应等。 B.5 蜱作为媒介可传播、携带多种人畜共患病以及动物疫病。蜱传播的疾病主要有:非洲猪瘟、 Q热、 立克次体病、莱姆病、兔热病、牛环形泰勒焦虫病、鼠疫、森林脑炎、克里米亚-刚果出血热、粒细胞无形体 病等。 B.6 在野生动物巢穴或家养畜舍中可找到硬蜱;在鸡巢内可找到软蜱。 8 SN/T53372021 (a) 背面观(b) 腹面观 说明: 1 顶突; 2 须肢; 3 颊叶; 4 假头基; 5 生殖孔; 6 盘窝; 7 基节褶; 8 基节; 9 转节; 1 0 股节; 1 1 胫节; 1 2
23、 后跗节; 1 3 跗节; 1 4 爪; 1 5 缘褶; 1 6 背腹沟; 1 7 气门板; 1 8 基节上褶; 1 9 肛前沟; 2 0 肛门; 2 1 肛后中沟; 2 2 肛后横沟。 图B.2 软蜱(钝缘蜱属) 9 SN/T53372021 附 录 C (规范性) 蜱属的形态学鉴定步骤 C.1 蜱科的确定(科检索表) ( 1 ) 身体背面具几丁质盾板或假盾区;假头向前,从背面可见;气门板显著,位于身体腹面,足基节的 后外侧;须肢各节几乎等长,或第节收缩,内陷于第节腔内( 2 ) 表皮革质,身体背面无盾板(原伪盾蜱属的种类具革质假盾区,但硬化程度不高)假头位于腹面前方,若 蜱和成蜱从背面不可
24、见;气门板不明显,位于足基节和之间的基节上褶上,须肢各节几乎等长,第 节不收缩,不内陷,不近端点软蜱科( A r g a s i d a e ) ( 2 ) 雌蜱身体背面具皱褶,前端具乳突状革质假盾区;覆盖物褶叠程度深;须肢3节,末节内陷不 明显纳蜱科( N u t t a l l i e l l i d a e ) 身体背面具明显坚硬的盾板,雌蜱和未成熟蜱覆盖背面前半部,雄蜱则覆盖整个背部;除几丁质板附近, 表皮上具有细小的褶或条纹;须肢第郁节收缩,内陷在第节腔内硬蜱科( I x o d i d a e ) C.2 硬蜱科各属的确定(属检索表) ( 1 ) 幼蜱须肢第节具爪须角蜱属(Corn
25、upalpatum) 幼蜱须肢第节不具爪( 2 ) ( 2 ) 肛沟围绕在肛门之前;无眼;雄蜱腹面几乎全部被几丁质板覆盖(共7块) ;幼蜱口下板后毛2对,背 部无矢状感器;通常为巢居性寄生,宿主不具专一性;雄蜱不吸血,分布广泛硬蜱属(Ixodes) 肛沟围绕在肛门之后,通常很小;眼有或无;雄蜱腹面无几丁质板,或发育不完全,仅分布在身体后端(肛 侧板、副肛侧板和肛下板) ;幼蜱仅1对口下板后毛,身体背部具矢状感器;通常不穴居或巢居;雄蜱吸 血,分布相对有地域性( 3 ) ( 3 ) 无眼(尤其成蜱和若蜱) ( 4 ) 多数具眼(但雄性原牛蜱属B o o p h i l u s的种类、光亮革蜱D
26、e r m a c e n t o r n i t e n s 和部分花蜱难以分辨) ( 5 ) ( 4 ) 假头基方形至矩形;须肢短,呈圆锥形,第节长宽约等,其外侧超出假头基边缘;幼蜱须肢3节,其 背面矢状感器前端具2对缘毛;宿主不具专一性(全球性分布,常见)血蜱属(Haemaphysalis) 雄性假头基背面四边形,其前侧缘分叉;雌性假头基六边形;须肢长,圆锥形,第节长约为宽的2倍,不 向外侧延伸;幼蜱不具以上特点(主要分布在中亚地区)异扇蜱属(Anomalohimalaya) ( 5 ) 气门板具不规则脊,部分具象牙色斑;缘垛9个(非洲)斑蜱属(Cosmiomma) 气门板正常,无脊或色
27、斑;缘垛有或无,但不是9个( 6 ) ( 6 ) 须肢显著长于假头基,第节长明显大于宽( 7 ) 须肢长度近似等于假头基,且第节长与宽大致相等( 9 ) ( 7 ) 盾板和须肢具色斑,须肢第节背面和腹面均具有凸缘;雄蜱具有成对的肛侧板,副肛侧板和肛下 板(印度、斯里兰卡、孟加拉国、老挝和尼泊尔,不常见)诺蜱属(Nosomma) 盾板色斑有或无,须肢第节背腹面不具凸缘,雄蜱腹面几丁质板有或无( 8 ) ( 8 ) 盾板不具色斑;雄蜱具肛侧板,且通常还具肛下板;缘垛不规则,部分愈合;眼着生在盾板侧缘的凹 陷内,半球形凸出璃眼蜱属(Hyalomma) 盾板一般具色斑,少数无色斑;雄蜱不具肛板和肛下板
28、曰缘垛规则,不愈合;如具眼,多数着生在盾板边 缘,通常周缘无凹陷,眼不凸出(主要分布在泛热带界,常见)花蜱属(Amblyomma) 01 SN/T53372021 ( 9 ) 成蜱口下板齿式2 / 2或3 / 3 ,内侧齿远小于外侧齿;幼蜱刚毛S 6附近有3个大蜡腺 凹沟蜱属(Bothriocroton) 成蜱口下板齿式多数3 / 3 ;幼蜱刚毛S 6附近仅1个蜡腺( 1 0 ) ( 1 0 ) 无缘垛,雄蜱的第对足很大(非洲,少见)巨足蜱属(Margaropus) 有缘垛,雄蜱的第对足正常( 1 1 ) ( 1 1 ) 假头基背面六角形,通常无色斑( 1 2 ) 假头基矩形,通常有色斑(世界
29、性广布种,常见)革蜱属(Dermacentor) ( 1 2 ) 盾板通常无色斑(除4种蜱) ;雄蜱具肛侧板和副肛侧板;雄蜱足基节不大于基节 ,无长 距;雌蜱足基节无两个短距(主要分布在非洲,但血红扇头蜱和微小扇头蜱为世界广布种) 扇头蜱属(Rhipicephalus) 盾板无色斑;雄蜱无肛侧板和副肛侧板;雄性足基节大于基节 ,且具2个长距;雌蜱的足基节 有2个短距(非洲,少见) 扇革蜱属(Rhipicentor) C.3 软蜱科(成蜱)各属的确定(属检索表) ( 1 ) 背腹间有明显的缝线分隔,身体侧面具明显的矩形盘(缘盘) ;眼付缺;成蜱和若蜱表皮有许多细小 皱纹和盘窝;宿主多为鸟类锐缘蜱
30、属(Argas) 背腹间无明显的缝线分隔;成蜱和若蜱表皮样式不一,呈乳突或结节状;无缘盘;有些种类具眼;宿主多 样( 2 ) ( 2 ) 若蜱表皮具刺;口下板发达;成蜱表皮覆盖物颗粒状,口下板退化;宿主为兔形目和偶蹄目动物 残喙蜱属(Otobius) 若蜱和成蜱表皮无刺;成蜱口下板多形但不退化;宿主多样( 3 ) ( 3 ) 若蜱或成蜱背板具一个光滑的升高区或假盾区;有些须肢第节具有大凸缘使口下板不太明显;口 下板宽阔,雌蜱如铲状,雄蜱退化败蜱属(Carios) 口下板多样,具齿但不呈铲状(宿主无蝙蝠)钝缘蜱属(Ornithodoros) 11 SN/T53372021 附 录 D (规范性)
31、 动物疫病传播媒介蜱形态鉴别特征 表D . 1规定动物疫病传播媒介蜱形态鉴别特征 表D.1 动物疫病传播媒介蜱形态鉴别特征 蜱科蜱属蜱种类形态学特征蜱传疫病 软蜱科 ( A r g a s i d a e ) 钝缘蜱属 (Ornithodoros) 锐缘蜱属(Argas) 非洲钝缘蜱 (Ornithodoros moubata) 虫体扁平,体躯比较软,无几丁质加厚的盾板,体 表为革质,椭圆形,有皱褶,表面呈颗粒状、乳头状 或具有放射形排列的盘状斑点,假头基位于虫体 腹面。雌雄外形相似,雌性体积比雄性体积大 非洲猪瘟、立克 次体病等 拉合尔钝缘蜱 (Ornithodoros lahorensis
32、) 土黄色,体椭圆形,前端尖窄,形成锥状顶突,雄虫 较为明显,后端宽圆。表皮呈皱纹状,密布星状小 窝。前半部中段有1对长形盘窝。中部及后部两 侧有几对圆形盘窝。肛前沟浅而不完整,无肛后 横沟。跗节 背缘有2个粗大的瘤突和1个粗 大的亚端瘤突 土拉菌病、布氏 杆菌病等 波斯锐缘蜱 (Argas persicus) 淡黄色,呈卵圆形,前部稍窄;体缘薄,由许多不规 则的方格形小室组成。背部表皮高低不平,形成 无数细密的弯曲皱纹;盘窝大小不一,呈圆形或卵 圆形,放射状排列 Q热、布氏杆菌 病、炭疽等 硬蜱科 ( I x o d i d a e ) 革蜱属 (Dermacentor) 森林革蜱 (Der
33、macentor silvarum) 雌蜱盾板近圆形,长等于或稍大于宽,白色珐琅斑 覆盖背板大部分,在颈沟周围及其后方留有2对 条形褐斑。气门板背突粗短,末端钝,其前缘无几 丁质加厚部;足基节4外距末端尖,超出该节后 缘,指向后方。雄蜱盾板白色珐琅斑不明亮,颈沟 深,侧沟浅,自加盾区后缘延伸至第一缘垛前角。 气门板长逗点形,背缘无几丁质加厚部。足基节 4向后显著延长,外距末端尖,超出该节侧缘 Q热、森林脑炎、 梨形虫病等 银盾革蜱 (Dermacentor niveus) 雌蜱须肢第节背缘无刺或不发达;须肢外缘呈 圆弧形凸出;盾板一般长大于宽,无半环形褐斑; 足基节无内距;足 - 胫节及后跗节
34、无腹距; 生殖孔多数具翼状突,否则假头基不明显或付缺; 足转节 背距略长,且末端尖细;基节外距末 端超出该基节后缘;气门板背突前缘具几丁质增 厚区;基节外距略微外弯;盾板珐琅色斑浓厚, 几乎覆盖整个盾板;转节 - 无腹距。雄蜱侧沟 较长而明显,盾板珐琅色斑较多且浓;足转节 背距略长,且末端尖细;基节外距超过该节后侧 缘;气门板背突前缘具明显的几丁质增厚部;基节 外距常短于其内距;假头基发达,末端尖窄;基 节外距较窄长,其长明显大于其基部之宽 Q热、立克次体 病等 21 SN/T53372021 表D.1 (续) 蜱科蜱属蜱种类形态学特征蜱传疫病 硬蜱科 ( I x o d i d a e )
35、革蜱属 (Dermacentor) 扇头蜱 (Rhipicephalus) 血蜱属 (Haemaphysalis) 网纹革蜱 (Dermacentor reticulates) 后构型蜱类,盾板有珐琅斑。须肢短粗,第2节背 部后方具隆突,口下板呈压舌板状或两侧近平形, 齿式通常3 / 3 ;假头基矩形;具眼且明显;转节1 背面后缘的距末端钝圆或尖细。雌蜱须肢第2节 背缘具明显的三角形刺,须肢外缘呈角状凸出; 雄蜱足基节向后方明显伸长,但该节只具外距, 无内距,须肢第节背部后缘具发达尖刺,其长度 明显大于宽度;基节 外距发达,并超出基节 立克次体病、森 林脑炎等 中华革蜱 (Dermacento
36、r sinicus) 体型较小,盾板珐琅彩少而淡,雄蜱仅在前部及中 部较明显,雌蜱在中部两颈沟之间及后方呈现底 色褐斑;雄蜱气门板近似钥匙形,背突端部微弯, 达盾板边缘,雌蜱呈圆逗点形,背突明显伸出,末 端钝 立克次体病、布 氏杆菌病等 边缘革蜱 (Dermacentor marginatus) 雌蜱足转节 背距略长,且末端尖细;基节外 距末端超出该基节后缘;气门板背突前缘具几丁 质增厚区;基节外距略微外弯,盾板珐琅色斑较 浅,后中部具小片褐斑;转节 - 具细小腹距。 雄蜱足转节 背距略长,且末端尖细;基节外 距超过该节后侧缘;气门板背突前缘具明显的几 丁质增厚部;基节 外距常短于其内距;假头
37、基 突较短粗;基节外距短,其长约等于其基部之宽 土拉菌病、 Q热、 森林脑炎、鼠 疫等 血红扇头蜱 (Rhipicephalus sanguineus) 体型中等。有眼,有缘垛。假头基宽短,六角形, 侧角明显。须肢短粗,中部最宽,前端稍窄。须肢 第1 , 2节腹面内缘刚毛较粗,排列紧密。雄蜱肛 门侧板近似三角形,长约为宽的2 . 5到2 . 8倍,内 缘中部稍凹,其下方凸角不明显或圆钝,后缘向内 略斜;副肛侧板锥形,末端尖细;气门板长逗点状 立克次体病、梨 形虫病等 微小扇头蜱 (Rhipicephalus microplus) 小型蜱。无缘垛,无肛沟,有眼但很小,假头基六 角形;须知很短,第
38、2 , 3节有横脊;雄虫有尾突,腹 面有肛侧板与副肛侧板各1对 Q热、梨形虫病、 莱姆病等 长角血蜱 (Haemaphysalis longicornis) 小型蜱。无眼,有缘垛。假头基矩形。须肢外缘 向外侧中度突出,呈角状;第2节背面有三角形的 断刺,腹面有一锥形的长刺。口下板齿式5 / 5 。 基节 - 内距稍大,超出后缘。盾板上刻点中等 大,分布均匀而较稠密 立克次体病、发 热伴血小板减少 综合征等 青海血蜱 (Haemaphysalis qinghaiensis) 与日本血蜱近似,区别在于此种蜱须肢外缘不明 显凸出,呈弧形而不呈角状,各跗节(尤其跗节 ) 较粗短。雄蜱气门板长逗点形,雌
39、蜱椭圆形 梨形虫病等 31 SN/T53372021 表D.1 (续) 蜱科蜱属蜱种类形态学特征蜱传疫病 硬蜱科 ( I x o d i d a e ) 血蜱属 (Haemaphysalis) 花蜱属 (Amblyomma) 硬蜱属 (Ixodes) 二棘血蜱 (Haemaphysalis bispinosa) 与长角血蜱近似,区别点为二棘血蜱较小,盾板刻点 细而较少,基节 - 内距较短,口下板齿式4 / 4 莱姆病、立克次体 病等 嗜群血蜱 (Haemaphysalis concinna) 成蜱须肢第三节无背刺,腹刺短,足基节1内距长而 尖,基节2 - 4内距粗短,不超过后缘。雌蜱盾板近圆
40、形。雄蜱盾板卵圆形,侧沟明显,前端伸达基节2水 平,后缘达第一缘垛 森林脑炎、布氏杆 菌病等 日本血蜱 (Haemaphysalis japonica) 雄蜱须肢有侧突,第二节侧突窄小。第三节后缘无 背刺,前端不伸长,不形成钳状,外侧缘超过假头基 侧缘。盾板有侧沟,向前伸达基节4前缘。各基节 距基本等长。齿式5 / 5 。雌蜱须肢外侧缘超过假头 基侧缘,须肢第二节侧突窄小。须肢第三节后缘无 背刺。各转节腹距短钝或呈嵴状。基节1内距稍窄 长,末端长,基节2 - 4内距约等长,三角形 森林脑炎、土拉菌 病等 龟形花蜱 (Amblyomma testudinarium) 大型蜱。体形较宽,盾板有明显
41、的珐琅色斑,雄蜱呈 圆三角形。眼大突出,明亮。有缘垛。假头基矩形; 须肢长,前端稍宽,第2节长约为第3节的2倍;口下 板齿式为4 / 4 立克次体病等 粒形硬蜱 (Ixodes granulatus) 躯体背部有几丁质的盾板,覆盖背部全部或前面一 部分;假头位于前端,从背面可见;肛沟围绕肛门之 前;雄蜱腹面几乎全部为几丁质板(共7块)所覆;须 肢较长,第2节明显长于第3节, 2节分界不明显;足 基节 内距明显;足基节 内距较长,末端尖;基节1 - 4 外距明显,呈粗齿;足基节 外距短或无;盾板非心 形,须肢窄长,前后两端明显细窄 莱姆病、立克次体 病等 中华硬蜱 (Ixodes sinensi
42、s) 雌蜱假头基基突粗短,耳状突短,圆钝,生殖沟后1 / 3 平行,肛沟两侧外斜,足基节1内距细长,末端达基 节2前缘。雄蜱假头基无基突,耳状突短小,圆钝, 或不明显,假头基横脊中部向后微弯,生殖中板向后 变宽,肛板两侧向后外斜,肛侧板前部明显宽于后 部,气门板卵圆形 莱姆病、无形体 病等 锐跗硬蜱 (Ixodes acutitarsus) 雌蜱足基节 有2个发达的长距;须肢比较窄(长约 为宽的4倍) ,盾板呈心脏形;假头基腹面横缝明显; 抓垫较短,约达抓长之半。雄蜱足基节 有2个发达 的长距,互相靠近外距末端超过基节前缘;盾板刻 点稀少,缘褶肥大;中板宽大,长度与宽度相等 莱姆病等 草原硬蜱
43、 (Ixodes crenulatus) 雌蜱假头基后侧角不向外突出;足长适中;须肢粗 短,且第节约等于或略长于第节,两节之间界限 不明显;足基节 无内距或内距不明显;足基节 - 无外距;耳状突呈脊状;盾板心形;假头基在两孔区 之间有弧形隆起;盾板侧沟较明显。雄蜱足基节 无 内距或不突出;基节 - 无外距或呈脊状;缘褶明显; 基节后缘无小刺;足长适中;肛板两端收窄或后部 渐宽;肛沟呈圆弧形;足基节 后内角尖细 鼠疫等 41 SN/T53372021 表D.1 (续) 蜱科蜱属蜱种类形态学特征蜱传疫病 硬蜱科 ( I x o d i d a e ) 硬蜱属 (Ixodes) 璃眼蜱 (Hyalo
44、mma) 卵形硬蜱 (Ixodes ovatus) 大型蜱。体形较宽,盾板有明显的珐琅色斑,雄蜱呈 圆三角形。眼大突出,明亮。有缘垛。假头基矩形; 须肢长,前端稍宽,第2节长约为第3节的2倍,口下 板齿式为4 / 4 森林脑炎、埃立克 体病等 全沟硬蜱 (Ixodes persulcatus) 小型蜱。无缘垛,无眼,肛沟围绕肛门前方。假头基 宽短,五边形,腹面有钝齿状的耳状突,须肢长而宽 扁。雄蜱腹面有7块板,即生殖前板、中板、肛板及1 对肛侧板和1对侧板,中板后缘弧度较深。基节 内 距细长,雌蜱末端达基节前1 / 3 ,雄蜱末端略超过基 节前缘 粒细胞无形体病、 莱姆病等 残缘璃眼蜱 (Hy
45、alomma detritum detritum) 大型蜱。须肢窄长。盾板表面光滑,刻点稀少。眼 相当明显,半球形,位于眼眶内。组细长,褐色或黄 褐色,背缘有浅黄色纵带,各关节处无淡色环带。雄 蜱背面中垛明显,淡黄色或与盾板同色;后中沟深, 后缘凸角粗短,比较明显;副肛侧板末端圆钝;肛下 板短小;气门板大,曲颈瓶形,背突窄长,顶突达到盾 板边缘。雌蜱背面侧沟不明显;气门逗点形,背面向 背方明显伸出,末端渐窄而稍向前 梨形虫病、莱姆 病、 Q热、克里米 亚-刚果出血热等 亚东璃眼蜱 (Hyalomma asiaticum) 大型蜱。足各关节有明显的淡色环;雄蜱后中沟达 不到中垛,后中沟与后侧沟之
46、间有稠密的细刻点,气 门板背突细长呈曲颈瓶形 克里米亚-刚果出 血热、 Q热、立克 次体病、鼠疫等 51 SN/T53372021 附 录 E (规范性) 样品DNA的抽提 E.1 将蜱2 5 m g组织置于冰冷的生理盐水中反复冲洗, 滤纸吸干表面水分后称量, (根据需要) ,置于匀浆研 磨器中并加入冷的生理盐水,进行手工匀浆研磨。注意整个过程在冰上完成。 E.2 将E . 1匀浆液倒入2 m L塑料离心管中,加2 0 L蛋白酶K ,再加S D S至终浓度为1 % ,上下颠倒混匀。 E.3 混合液置于5 5 水浴,水浴2 . 5 h 。 E.4 向匀浆液中按1 1比例加入酚/三氯甲烷/异戊醇混
47、合液( 2 5 2 4 1 ) ,轻轻振荡混匀5 m i n , 1 2 0 0 0 g离 心5 m i n 。 E.5 吸上层水相8 0 0 L于一灭菌塑料离心管中,加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液,轻轻震荡混匀5 m i n , 1 2 0 0 0 g离心5 m i n 。 E.6 吸上层水相5 0 0 L于一塑料离心管中,加入两倍体积的无水乙醇, - 2 0 放置2 h或液氮中放置 5 m i n 。 E.7 1 2 0 0 0 g离心5 m i n ,沉淀D N A ,倾去上清液。 E.8 于沉淀中加入7 5 %乙醇溶液5 0 0 L ,轻轻混匀后1 2 0 0 0 g离心5 m i n ,倾去上清液,室温凉干。 E
