1、ICS 65.020 B 16 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/ T 3788 2020 梨枯梢 病 监测与检测技术规程 Technical specification for monitoring and detection of Shoot Blight of Asian pear 2020 - 04 - 08 发布 2020 - 05 - 15 实施 江苏省 市场监督管理 局 发布 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出 并归口 。 本标准起草单位：江苏省农业科学院 。 本标准主要起草人：刘凤权、徐会永、赵杨扬、 赵
2、延 存、 孙伟波 。 1 梨枯梢病 监测 与 检测 技术规程 1 范围 本标准规定了 梨枯梢 病监测与检测 的 原理、 试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果 判定和报告、 样品、菌种保藏和无害化处理 、 疫情处 置 等要求 。 本标准适用于 梨枯梢病 田间 监测 以及苗木、砧木、接穗和果实 上 传带的 梨枯梢病 菌 的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少 的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2292 亚洲梨
3、火疫病监测技术规范 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求 3 原理 梨枯梢 病 ， 病原为 亚洲梨火疫 病菌 （ Erwinia pyrifoliae Kim et al.） ， 是为害梨树的重要细菌病害 之 一， 属我国规定的检疫性有害生物。 可以根据 田间症状、菌落形态 和 培养特 征 、 致病性 、 免疫学 反应 和 分子生物学 特征 等 进行 监测与 检测。 4 试剂与材料 检测 中所需的所有 试剂与培养基，参见附录 A。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 试验 用水应符合 GB/T 6682中一级水的规格。 5 仪器与
4、用具 超 净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、 显微镜、高速台式离心机、 电泳仪、常规 PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移 液器 、制冰机 等。 6 监测 技术 6.1 监测植物 梨 ， 主要监测亚洲梨 。 2 6.2 监测区域 重点监测 亚洲梨集中种植区 、 引种繁育基地、 苗木 集散地 等疫情 发生高风险 区 。 6.3 监测方法 6.3.1 苗木 监测 对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的 苗木，按照 SN/T 1157要求进行抽样， 并对样品进行 室内检测。 6.3.2 田间 监测 从梨树开花期开始， 对 当地
5、农技员、果农等相关人员 进行访问 调查 ， 并 选择有 代表性的梨园 进行踏 查。 重点观 察田间有无梨枯梢病典型症状（见附录 B）， 如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样， 样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨 园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信 息进行记录（见附录 C）。 在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测 。 从梨树开花 期开始， 每隔 7 d调查一次。 采用 5 点取样法，每点随机调查 5株， 统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。 监测 过程 中病梢的选取 按照 NY/T 2292中的规定执行。 7 检测技术 7.1 样品处理 选择表现典型症状并带
6、有菌脓的植物 部位 如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等 ，在无菌条件下切取 病健交界处组织约（ 3 mm 5 mm） （ 3 mm 5 mm），表面消毒和清洗后， 在 装有 适量 无菌水的离心 管中轻轻挤压 ， 浸泡 10 min 30 min后制成样品悬浮液。 或者直接挑取菌脓并用无菌 水 清洗后制成样品 悬浮液。悬浮液可 用于其后的形态观察、免 疫学和分子生物学检测等。 7.2 检测方法 7.2.1 显微镜检查 对于疑似症状 的植物组织 ， 切取病健交界处 20 mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低 倍显微镜 下 观察 有无喷菌现象。 7.2.2 培养特征 检测 将 样品 悬浮液在
7、 YPDA培养基平板上划线或稀释分离， 28 倒置培养 24 h 72 h。 在 YPDA培养基平 板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征 以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录（ 参 见附录 B）。 7.2.3 形态特征 检测 按照常规 染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况 、 有无鞭毛及鞭毛着生的位 置和 数目 、 是否产生荚膜和芽胞 、 芽胞着生的部位和形状 、 细胞内含物 等 特 征 。 7.2.4 致病性测定 3 取梨幼果（直径大约 3 cm 5 cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实， 置于 垫 有 湿润的 灭菌
8、滤纸 的培 养皿中 。用无菌接种针蘸取培养 24 h 36 h的 菌落 ， 针刺接种于幼果 果肉组织，一个横切面接种 3个 4 个点。 接种后 26 保湿 培养， 24 h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生 和菌脓 形成 。 以无菌水为对 照。 7.2.5 ELISA 检测 挑取少量分离到的病原菌配制成 108CFU/mL悬浮液 进行 ELISA检测 ，检测程序 参 见附录 D。 如 采用 商品化 ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。 7.2.6 PCR 检测 挑取少量分离到的病原菌配制成 108CFU/mL悬浮液， 1 mL菌悬液提取 DNA后进行 PCR检测，检测 程序
9、见附录 E。 如采用市售的试剂盒，按说明操作。 检测过程中防污染措施按照 SN/T 1193中的规定执行。 8 结果判定 和 报告 8.1 结果判定 8.1.1 症状识别判定 田间梨树发病症状符合附录 B描述的梨枯梢病典型症状，判断为梨枯梢病。 8.1.2 常规 检测 结果判定 镜检有菌溢现象 ； 分离 物 形态特征和培养特性 与 梨枯梢病菌 相符 （ 参 见附录 B） ； 致病性 测定可在 接种部位 产生 高度 隆起的乳白色菌脓，最后组织变褐坏死 ，但不发臭； 能再次从接种发病部位分离到目 标病原菌， 确定病原菌为梨枯梢病菌。 8.1.3 ELISA 检测 结果判定 在阴性对照 OD值 0.
10、1，且阳性对照 OD值大于阴性对照 OD值 2倍的前提下，样品孔 OD值大于阴性 对照 OD值 2倍时，判定为阳性反应，即样品带有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带梨枯梢 病菌。 8.1.4 PCR 检测 结果判定 观察电泳结果，阳性对照在 476 bp处有条带出现，且阴性对照无条带，待测样品在 476 bp处有条带 出现，判断样品中含有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品中不带梨 枯梢病菌。 8.2 结果 报告 8.2.1 监测报告 记录监测结果并填写疫情监测记录表（见附录 C）。对监测结果进行整理汇总，形成监测报告。 8.2.2 检测 报告 将实验室检测鉴定结果填入植物有害生物样
11、本 检测 报告（见附录 F）。 4 9 样品、菌种保 藏和无害化处理 9.1 样品保藏 未发现梨枯梢病的样品 保藏 6个月，发现梨枯梢病的样品 保藏 1年，有贸易纠纷的样品 保藏至少 1年， 以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保藏到纠纷解决完毕。 保藏样品要标明样品编号、样品名称、保藏人、 保藏日期和到期日期。 样品保藏期满后，需经灭 活 销毁 处理。 9.2 菌种保藏 分离得到的梨枯梢病菌菌 株应妥善保存，防止扩散。 9.3 无害化处理 监测和 检测 过程中使用 过 的有关材料和用具，在使用完毕后须及时进行灭 活 销毁处理。 10 疫情处 置 经监测或室内检测发现 梨枯梢病 ，应指导生产、销售和
12、个人实施检疫处治及病害防治。 5 A A 附 录 A （资料性附录） 试剂及培养基的配制方法 A.1 ELISA检测 A.1.1 包被 液 Na2HCO3 2.93 g、 NaCl 1.59 g，用蒸馏水溶解，调整 pH值到 9.6，定容至 1000 mL。 A.1.2 洗涤液 Na2HPO412H2O 3.58 g、 KCl 0.2 g、 KH2PO4 0.27 g、 NaCl 8.01 g、吐 温 -20 0.5 g，用蒸馏水溶解 ，调 整 pH值到 7.4， 定容至 1000 mL。 A.1.3 样品提取液 Na2HPO412H2O 3.58 g、 KCl 0.2 g、 KH2PO4 0
13、.27 g、 NaCl 8.01 g， 用蒸馏水溶解， 调整 pH值到 7.4， 定容至 1000 mL。 A.1.4 封闭液 脱脂奶粉 5 g， 溶解于 100 mL样品提取液。 A.1.5 抗体稀释液 脱脂奶粉 2.5 g， 溶解于 100 mL洗涤液。 A.1.6 TMB显色液 A.1.6.1 底物缓冲液 Na2HPO412H2O 2.375 g、柠檬酸 1.1675 g， 用蒸馏水溶解 ，调整 pH值到 5.0， 定容至 250 mL。 A.1.6.2 TMB母液 10 mg TMB溶于 1 mL二甲亚砜（ DMSO）中， 4 保存 。 A.1.6.3 0.75%H2O2 取 25 L
14、 30% H2O2用超纯水定容到 1 mL， 4 避光保存。 A.1.6.4 显色液 配置：在 10 mL底物缓冲液加入 100 L TMB母液和 32 L 0.75% H2O2混匀后使用，需要现配现用。 A.1.7 终止液 浓硫酸 11.1 mL，用蒸馏水定容到 100 mL。 6 A.2 PCR检测 A.2.1 电泳缓冲液 TBE Tris碱 54 g、硼酸 27.5 g、 0.5 M EDTA（ pH8.0） 20 mL， 用蒸馏水溶解定 容至 1000 mL。 使用时利 用 蒸馏水 10倍稀释，即为 0.5TBE。 A.2.2 琼脂糖凝胶 在 0.5TBE工作液中加入 1% (w/v)
15、的琼脂糖， 加热 融化，冷却至 60 倒入插入梳子的制胶槽中，冷 却凝固后点样电泳。 A.2.3 上样 缓冲液 溴百里酚蓝 0.025 g，乙二醇 3 g， 溶解于 10 mL蒸馏水。 A.3 YPDA培养基 A液： 聚蛋白胨 20 g，酵母提取物 10 g，溶解于 850 mL水中， 121 湿热灭菌 20 min； B液：葡萄糖 20 g，溶解于 100 mL水中， 115 湿热灭菌 15 min； C液：腺嘌呤硫酸盐 20 mg，溶解于 10 mL水中， 115 湿热灭菌 15 min； 将 A、 B、 C三种溶液混合，用无菌水定容至 1000 mL。 如制作平板，在 A溶液中加入 15
16、 g琼脂粉。 7 B B 附 录 B （资料性附录） 梨枯梢 病基本信息 B.1 分类地位 梨枯梢病菌 （ Erwinia pyrifoliae Kim et al.） 属于 细菌 界（ Bacteria） 、 变形 菌门（ Proteobacteria）， -变形菌纲（ Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（ Enterobacteriales）、 肠杆菌 科（ Enterobacteriaceae）， 欧文氏菌 属 （ Erwinia），在 亚洲 梨 （ Nashi pear， Pyrus pyrifolia） 引起 梨枯梢 病 ，为亚洲梨树上的重要 检疫性病害。 B.2 形
17、态特征 革兰氏阴性菌，周生鞭毛， 短 杆状， 兼性厌氧 。 菌体大小为 0.8 m（ 1.0 m 3.0m），以单个、 成对或短链形式存在。 B.3 生物学特性 病菌最适生长温度 25 27.5 。在 YPDA培养基上 28 培养 48 h后，菌落大小直径为 2 mm，呈圆 形、白色、凸起、不透明 。 B.4 发病规律 病原菌在病树上越冬。翌年春天在潮湿环境中，病原菌活跃繁殖，可以通过蜜蜂、蚂蚁等昆虫粘带 传播，也 可以通过雨水飞溅传播。病原菌通过花器、自然孔口（ 皮孔 、 气孔）或伤口侵入，在嫩枝中的 胞间或者导管中扩散。 B.5 田间症状特征 B.5.1 花簇与嫩枝 花簇上的症状一般在花瓣
18、脱落 1 周 2 周后表现。花器被害后呈萎蔫状，深褐色，并向下蔓延至花 柄，使花柄呈水渍状，然后皱缩变成黑褐色，脱落或干枯后仍悬挂在树枝上，花梗上 有 橘红色菌脓渗出。 嫩枝的症状与花期相似，但病害发展更快。嫩枝尖可迅速枯萎形成 “ 牧羊鞭 ” 状。感病叶片常发黑沿中 脉扩展至完全坏死。许多患病的嫩芽、梢和树叶，使一棵树看似被烧焦，枯萎。 B.5.2 树干与枝条 新枝皮色变黑，水渍状，枝尖萎蔫 下弯，呈“牧羊鞭”状；多年生枝中部皮层凹陷向前向后蔓延， 造成大枝、中心干整枝或整株死亡；枝条、骨干枝和主干表皮流出锈红色液体；拨开皮层韧皮、木质部 组织呈黄褐色。 8 B.5.3 叶片 沿主脉或沿叶边
19、缘及两脉之间形成黑褐色的病斑。随着变色加深，叶片卷曲萎缩下垂， 干枯挂在枝 上不脱落，叶柄变黑，叶柄上有桔红色菌浓。 B.5.4 果实 未成熟的果实受侵染时出现水渍状，然后呈褐色收缩，逐渐变黑 ， 受侵染果实 不易脱落 。 幼果 出现 黑色斑点、 斑 块，局部或整个表皮先变黑，后延伸至果肉，果柄通常有菌脓；果实生长期间一直不断随 枝发病萎焉皱缩挂在树上失去商品 性。 9 C C 附 录 C （规范性附录） 疫情 监测记录表 调查单位： 调查时间： 编号 作物品种 调查地点 调查株数 疑似症状表现株数 监测结果 调查人（签字）： 10 D D 附 录 D （资料性附录） 梨枯梢 病菌 双抗 EL
20、ISA 检测程序 D.1 包被 捕 获抗体 提前按照市售产品要求用包被液进行稀释， 然后每孔加入 100 L包 被于 96孔酶标板上。 4 孵育 12 h 16 h后弃去孔中液体 ， 用 洗涤液 加满每个反应孔，静置 1 min 2 min后，将 洗涤液 缓慢倒出， 重新加入新的 洗涤液 ，重复上述步骤 3次。洗板完成后将 酶标板 倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中 的水分。 D.2 封闭 酶标板中 每孔 加入 200 L封闭液， 37 封闭 1.5 h后弃去封闭液， 用 洗涤液 洗板 3次，每次 2 min。 洗 板完成后将 酶标板 倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。 D.3 加样
21、加入梯度稀释的梨枯梢病菌菌液， 每孔 100 L。室温孵育 1 h后弃去 孔中液体，用 洗涤液 洗板 4次， 每次 2 min。洗板完成后将 酶标板 倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。 D.4 加 酶标 检测 抗体 -HRP复合物 每孔加入 100 L检测 抗体 -HRP复合物 ， 抗体 HRP复合物 提前按照 市售产品要求 进行稀释，置于保 湿容器中， 25 孵育 1 h。 用 洗涤液 洗板 4次，每次 2 min。 洗板完成后将 酶标板 倒置于干净的吸水纸上， 吸干反应孔中的水分。 D.5 显色 提 前 15 min配好 显色液 ， 每孔加入 100 L， 25 避光 显色 20
22、min至阳性对照显色。 D.6 终止反应 显色后在每孔加入 50 L终止液。 D.7 测定 在波长 450 nm下用酶标仪 测量结果 ，读取各孔溶液的光密度值（ OD值），记录结果 。 11 E E 附 录 E （资料性附录） 梨枯梢病菌 PCR 检测 程序 E.1 DNA提取 挑取少量分离到的病原菌配制成 108CFU/mL悬浮液， 1 mL菌悬液按照市售 DNA提取试剂盒要求提 取 DNA。 提取后用蛋白 /核酸分析仪鉴定 DNA质量，当 A260/A280比值为 1.8 2.0时，适合于 PCR扩增。 E.2 引物 上游引物（ HrcCF） :5-GACGTTTGCACCTGGAAACC
23、G-3； 下游引物（ HrcCR） :5-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3； 扩增产物为 476 bp。 E.3 反应体系 见表 E.1. E.4 反应条件 94 变性 3 min；进入循环， 94 变性 30 s， 62 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 30个循环；最后 72 延 伸 5 min。 如采用市售的试剂盒，按照说明作适当调整。 E.5 电泳分析 取 5 L PCR扩增产物与 1 L的 6上样缓 冲液混合均匀， 上样于 1.5%琼脂糖凝胶中， 80 V电泳 1 h， 溴化乙锭（ EB）染色 20 min 30 min后，凝胶成像系统中观察，记录观察结果。 反应组成 体积， L 10PCR buffer 5 25 mm MgCl2 3 25 mm dNTP 2 引物（ 20 m） 1 5 U/L Taq DNA聚合酶 0.5 模板 DNA 2 ddH2O 34 总体积 50 12 F F 附 录 F （规范性附录） 植物有害生物样本 检测 报告 植物名称 品种名称 植物生育期 样品数量 取样部位 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测 方法： 检测 结果： 备注： 检测 人（签名）： 审核人（签名）： 检测 单位盖章： 年 月 日 注：本单一式三份，检测单位、受检单位和检疫机构各一份。
