1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5185 2020 猪副伤寒检疫技术规范 Quarantine protocol for swine paratyphoid 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 I 前 言 本文件是按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国潍坊海关、中华人民共和国深圳 海关、中华人民共和
2、国合肥海关。 本文件主要起草人：张体银、郑腾、田国宁、白泉阳、花群义、宗凯、王武军、张志灯、 于师宇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 1 猪副伤寒检疫技术规范 1 范围 本文件规定了猪副伤寒的临床诊断、病原的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应 和实时荧光聚合酶链式反应鉴定技术。 本文件适用于猪副伤寒临床诊断和实验室检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682
3、 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 BSA 牛血清白蛋白（bovine serum albumin） DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（ethidium bromide） ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay） HRP 辣根过氧化物酶（h
4、orseradish Peroxidase） LPS 脂多糖（lipopolysaccharide） PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） TBE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid） 4 临床诊断 4.1 临诊症状 4.1.1 急性败血性 体温突然升高（41 42 ），精神不振，食欲废绝。呼吸困难，耳根、胸前和腹下皮肤有紫红 色斑点，后期或有下痢。有时在出现临诊症状后 24 h 内死亡，但多数
5、病程为 2 d 4 d，病死率很高。 4.1.2 亚急性和慢性 病猪体温升高（40.5 41.5 ），精神不振，寒颤，喜钻垫草，扎堆，眼有粘性或脓性分泌物， 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 2 少数角膜混浊，严重者发展为溃疡，甚至眼球被腐蚀。病猪食欲不振，初便秘后下痢，粪便淡黄色或 黄绿色，恶臭。被毛粗乱，贫血，长期拉稀，粪便含纤维素、坏死组织或饲料凝块。有的皮肤出现弥 漫性湿疹。生长发育不良，呈典型僵猪。 4.2 病理变化 4.2.1 急性型 主要为败血症变化。脾常肿大，色暗带有蓝色，坚实似橡皮，脾髓质不软化。肠系膜淋巴结索状 肿大，其他淋巴结也有肿大，呈大理石状。肝、肾也有
6、不同程度的肿大、充血和出血，肝实质有时可 见黄灰色坏死点。全身黏膜、浆膜均有不同程度的出血斑点，肠胃黏膜可见急性卡他性炎症。 4.2.2 亚急性和慢性型 主要为坏死性肠炎。盲肠、结肠肠壁增厚，黏膜覆盖一层弥漫性坏死和腐乳状物质，呈糠麸状， 底部为红色、边缘不规则的溃疡面。肠系膜淋巴结索状肿胀，部分呈干酪样变。脾肿大。肝有时可见 黄灰色坏死点。 5 病原的分离和鉴定 5.1 仪器和设备 5.1.1 培养箱（37 1 和 42 1 ）。 5.1.2 高压灭菌器。 5.1.3 玻璃研磨器或组织匀浆机。 5.1.4 台式高速离心机。 5.1.5 级生物安全柜或者超净工作台。 5.1.6 水浴锅。 5.
7、1.7 冰箱（2 4 和 20 ）。 5.1.8 无菌吸管。 5.1.9 全自动微生物生化鉴定系统。 5.2 培养基和试剂 5.2.1 水：符合 GB /T 6682 中一级水的规格。 5.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW），配制方法见 A.1。 5.2.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液，配制方法见 A.2。 5.2.4 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，配制方法见 A.3。 5.2.5 科玛嘉沙门菌属显色培养基琼脂。 5.2.6 亚硫酸铋（BS）琼脂，配制方法见 A.4。 5.2.7 Hektoen Enteric（HE）琼脂，配制方法见 A.5。 5.2.8 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂，配
8、制方法见 A.6。 5.2.9 胆硫乳（DHL）琼脂，配制方法见 A.7。 5.2.10 营养琼脂，配制方法见 A.8。 5.2.11 三糖铁（TSI）琼脂，配制方法见 A.9。 5.2.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基，配制方法见 A.10。 5.2.13 蛋白胨水、靛基质试剂，配制方法见 A.11。 5.2.14 尿素琼脂（pH 7.2），配制方法见 A.12。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 3 5.2.15 氰化钾（KCN）培养基，配制方法见 A.13。 5.2.16 邻硝基酚 -D 半乳糖苷（ONPG）培养基，配制方法见 A.14。 5.2.17 丙二酸钠培养基，配制方法
9、见 A.15。 5.2.18 革兰氏阴性细菌鉴定卡。 5.2.19 沙门菌 O 和 H 诊断血清。 5.3 样品采集 取样按照 GB /T 18088 的规定执行。无菌采集存活动物的新鲜粪便或直肠棉拭子样品；病死或带 菌动物的肝脏、胆囊、脾脏及其他病变组织，盲肠扁桃体及肠内容物。 5.4 样品保存 样品均放入 4 冰箱内保存，并在冷藏状态下 24 h 内送到指定实验室。 5.5 细菌分离 5.5.1 总则 涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照 GB /T 19489 要求 进行。 5.5.2 非污染样品 取组织器官和胆囊内容物，无菌条件下选择 2 种选择性琼脂平
10、板（科玛嘉显色培养基琼脂、HE 琼脂、XLD 琼脂、DHL 琼脂、BS 琼脂等）进行划线接种培养，同时将组织器官匀浆，1 ： 10 的体积 接种 BPW，36 1 培养 18 h 24 h，之后再按 1 ： 10 的体积转接 TTB 增菌液和 SC 增菌液，分 别于42 1 和36 1 培养24 h 和48 h后，再选择2种同样的选择性琼脂平板划线接种培养， 若出现表 1 中的菌落特征，可以判为可疑菌落，挑取可疑菌落进一步鉴定。如果没有发现可疑菌落， 则判定为细菌分离为阴性。 表 1沙门菌属在不同琼脂平板上的培养条件和菌落特征 培养基种类 培养条件 沙门菌菌落特征 科玛嘉显色培养基琼脂 36
11、1 培养 18 h 24 h 菌落呈淡紫色至紫红色 HE 琼脂 36 1 培养 18 h 24 h 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心为黑色或全黑色；有些菌株为黄色，中心 为黑色或几乎全黑色 XLD 琼脂 36 1 培养 18 h 24 h 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中 心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心 DHL 琼脂 36 1 培养 18 h 24 h 菌落为无色半透明带有黑色中心，有些菌落中心无黑色沉淀物 BS 琼脂 36 1 培养 40 h 48 h 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈现黑色或 棕色，有些菌株形成
12、灰绿色的菌落，周围培养基颜色不变 5.5.3 污染样品 将直肠棉拭子、新鲜粪便、盲肠扁桃体、肠内容物等污染样品（非液体性样品最好先制成匀浆 液），按 1 ： 10 的体积接种 BPW，36 1 培养 18 h 24 h，其余步骤同 5.5.2. 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 4 5.6 生化试验 5.6.1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于 底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 1 培 养 18 h 24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂
13、和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门菌属的反应 结果见表 2。 表 2沙门菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A +（-） +（-） + 可疑沙门菌 K A +（-） +（-） - 可疑沙门菌 A A +（-） +（-） + 可疑沙门菌 A A +/- +/- - 非沙门菌 K K +/- +/- +/- 非沙门菌 注： K ：产碱；A ：产酸；+ ：阳性；- ：阴性；+（-）：多数阳性，少数阴性；+/- ：阳性或阴性。 5.6.2 二次生化试验 根据 5.6.1 初步判断结果，从可疑沙门菌对应的营养琼脂平板上
14、挑取菌落分别接种蛋白胨水（供 做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，于 36 1 培养 18 h 24 h，必要 时可延长至 48 h，个别情况要补做甘露醇和山梨醇试验或 ONPG 试验，按表 3 判定结果。将已挑菌落 的营养琼脂平板储存于 2 5 或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。 表 3沙门菌属生化反应鉴别表 硫化氢 （H 2 S） 靛基质 pH7.2 尿素 氰化钾 （KCN） 赖氨酸脱 羧酶 补充试验 结果判定 + - - - + / 沙门菌属 + - - - - / 甲型副伤寒沙门菌（要求血清学鉴定结果） + - - + + / 沙门菌或（要求血清学鉴
15、定结果） + - + - + / 沙门菌个别变体（要求血清学鉴定结果） + + - - + 甘露醇试验：+ 山梨醇试验：+ 沙门菌属（要求血清学鉴定结果） - - - - + ONPG 试验：- 沙门菌属 - - - - - ONPG 试验：- 甲型副伤寒沙门菌（要求血清学鉴定结果） 注： + ：阳性；- ：阴性；/ ：不需要。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 5 5.6.3 沙门菌生化群鉴定 （ 必要时 ） 根据需要可以选择性进行沙门菌生化群鉴定，见表 4。 表 4沙门菌属各生化群的鉴别 项目 卫矛醇 + + - - + - 山梨醇 + + + + + - 水杨苷 - - -
16、 + - - ONPG - - + - + - 丙二酸钠 - + + - - - KCN - - - + + - 注： + ：阳性；- ：阴性。 5.6.4 全自动微生物生化鉴定系统 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据 5.6.1 的初步判断结果，从营养琼脂 平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生 化鉴定系统进行鉴定。 5.7 血清学试验 5.7.1 抗原的准备 一般采用 1.2 1.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在 琼脂量较高的 （如 2 3） 培养基上再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在
17、而阻止了 O 凝集反应时， 可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将 菌株接种在 0.55 0.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查。 5.7.2 多价菌体抗原 （ O） 鉴定 在玻片上划出 2 个约 1 cm2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1 /2 环于玻片上的每一区域上 部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集
18、现象皆为阳性反应。 5.7.3 多价鞭毛抗原 （ H） 鉴定 同 5.7.2。 5.8 结果判定 生化试验结果与沙门菌属生化特性完全符合时，判定为沙门菌阳性。生化试验沙门菌可疑时，综 合生化试验和血清学鉴定结果，若血清学反应 O 抗原或 H 抗原阳性，则判定为沙门菌阳性；若血清 学反应 O 抗原和 H 抗原全部阴性，则判定为沙门菌阴性。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 6 6ELISA 试验 6.1 仪器和设备 6.1.1 96 孔酶标板。 6.1.2 振荡混匀器。 6.1.3 洗板机。 6.1.4 酶标仪。 6.1.5 单道可调微量移液器一套（0.5 L 10 L、20 L
19、200 L、100 L 1 000 L）、12 道可调微 量移液器（10 L 100 L ）。 6.1.6 冰箱（2 4 和 20 ）。 6.2 试剂 6.2.1 水：符合 GB /T 6682 中一级水的规格。 6.2.2 ELISA 标准抗原：肠炎沙门菌 LPS，由指定单位提供。 6.2.3 标准阴性血清。 6.2.4 标准阳性血清。 6.2.5 HRP 标记的抗体。 6.2.6 BSA。 6.2.7 吐温 -20。 6.2.8 0.01 mol/L PBS 缓冲液，配制方法见 A.16。 6.2.9 包被液，配制方法见 A.17。 6.2.10 洗涤液，配制方法见 A.18。 6.2.1
20、1 封闭液，配制方法见 A.19。 6.2.12 稀释液，配制方法见 A.20。 6.2.13 底物溶液，配制方法见 A.21。 6.2.14 终止液，配制方法见 A.22。 6.3 样品采集制备 常规方法采集动物血，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品 1 周内检测 可存放于 2 8 ，超过 1 周应置于 -20 。 6.4 操作步骤 6.4.1 也可采用其他等效的商业化试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作。 6.4.2 用包被液将标准抗原稀释至1 g/mL，将稀释好抗原加入96孔酶标板内，每孔加100 L， 4 包被过夜。 6.4.3 每个反应孔加入约 300 L 的洗涤液进
21、行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸水纸上将酶标 板拍干。 6.4.4 每孔加封闭液 200 L，37 孵育 1 h。 6.4.5 重复步骤 6.4.3。 6.4.6 待检血清用稀释液作 1 ：20 稀释，把稀释好的血清加入反应孔内，每孔 100 L ；同时设立阳 性血清、阴性血清对照各 2 孔，每孔 100 L。置 37 孵育 1 h。 6.4.7 重复步骤 6.4.3。 6.4.8 把稀释好的 HRP 标记抗体加入各孔，每孔加 100 L，置室温反应 30 min。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 7 6.4.9 重复步骤 6.4.3。 6.4.10 每孔加入底物溶液
22、100 L，室温条件下避光孵育 15 min。 6.4.11 每孔加 100 L 终止液终止反应，10 min 内以 490 nm 波长测 OD 值。 6.5 结果判定 6.5.1 判定条件 只有当阳性对照平均 OD 值 1.0，阴性对照平均 OD 值 0.20 时，试验成立可进行结果判定； 否则重新试验。 6.5.2 计算 P /N值 P/N 值计算见式（1）： P / N = （待检血清平均OD值 - 空白对照平均OD值） （阴性血清平均OD值 - 空白对照平均OD值） （1） 6.5.3 判定标准 6.5.3.1 P/N 2.0 时，判为待检血清猪副伤寒抗体阳性。 6.5.3.2 1.5
23、 P /N 2.0 时，判为可疑。对可疑样品重检一次，重检后若 P /N 1.5，判为待检血 清猪副伤寒抗体阳性；若 P /N 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阴性。 6.5.3.3 P/N 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阴性。 7 聚合酶链式反应 （ PCR） 7.1 仪器和设备 7.1.1 二级生物安全柜。 7.1.2 高速冷冻离心机。 7.1.3 水浴锅。 7.1.4 PCR 扩增仪。 7.1.5 水平电泳仪。 7.1.6 凝胶成像仪。 7.1.7 微量移液器。 7.1.8 高压灭菌锅。 7.1.9 冰箱（2 4 和 20 ）。 7.2 试剂 7.2.1 水：符合 GB /T 6682
24、 中一级水的规格。 7.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW），配制方法见 A.1。 7.2.3 Taq DNA 聚合酶。 7.2.4 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 7.2.5 10PCR 缓冲液。 7.2.6 琼脂糖（电泳纯）。 7.2.7 TBE 电泳缓冲液，配制方法见 A.23。 7.2.8 上样缓冲液，配制方法见 A.24。 7.2.9 DNA 相对分子质量标准品。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 8 7.2.10 EB，配制方法见 A.25。 7.2.11 DNA 纯化回收试剂盒。 7.3 引物 （ Primer） 根据肠炎沙门菌 hut 基因序
25、列设计，扩增长度为 495 bp，序列为： 上游引物 hut-F ：5- ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA -3 下游引物 hut-R ：5- ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG -3 引物纯度为 PAGE 级，用 ddH 2 O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。 7.4 质控物质 使用肠炎沙门菌标准菌株（ATCC13 076）作为阳性对照；使用不含沙门菌的组织或培养物作为 阴性对照；用 ddH 2 O 作为空白对照。 7.5 样品采集 同 5.3。 7.6 样品的准备 将受测细菌单个菌落接种到 10 mL BPW 增菌液内，临床样品（非液
26、体性样品最好先制成匀浆液） 按1 ： 10 的体积接种 BPW，36 1 培养 18 h 24 h ；同时制备阳性对照和阴性对照菌株菌液。 无菌取 1.5 mL 培养物到灭菌的 EP 管内，12 000 r /min 离心 3 min，弃去上清液，加入 1.5 mL ddH 2 O 水重悬沉淀；12 000 r /min 离心 3 min，弃去上清液，再次加入 1 mL ddH 2 O 重悬沉淀。 7.7DNA 提取 将上述菌重悬液在沸水中煮 15 min，10 000 r /min 离心 3 min 沉淀菌体碎片，上清液内即含有细 菌基因组 DNA，将上清液转移到干净的离心管内 -20 保存
27、备用。细菌基因组 DNA 的提取也可采用 等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按照说明书要求进行操作。 7.8PCR 扩增 7.8.1 反应体系 在 PCR 中加入 10PCR 缓冲液 2.5 L、5 U /L Taq DNA 聚合酶 0.25 L、10 mol/L 的引物 hutF 和 hutR 各 1.0 L、2.5 mmol /L dNTPs 0.5 L、模板 DNA 2.0 L，补充 ddH 2 O 至 25 L。PCR 扩增可以 采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。 7.8.2 反应程序 94 预变性 5 min ；之后 94 变性 45 s，56 退火 30 s，72 延伸 45
28、s，共 30 个循环；72 补充延伸 10 min，4 保温。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。 7.8.3 琼脂糖凝胶电泳 用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5% 的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶 面。将 6 L 样品和 2 L 上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标 准物 Marker 作对照。5 V /cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 9 7.9 凝胶成像分析和测序 将电泳完毕的凝胶放入含 0.5 g/mL EB 溶液中染色 10 min 30 min 后，在水中漂
29、洗凝胶，用凝 胶成像仪观察并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约 495 bp 的 DNA 片段，应切胶回收 DNA 片段进行测序，参考序列参见 B.1。 7.10 结果判定 经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条大小约 495 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照无条 带时，试验成立。待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证者为阳性。 无条带或条带的大小不是 495 bp 的为阴性。 8 实时荧光 PCR 8.1 仪器和设备 8.1.1 二级生物安全柜。 8.1.2 高速冷冻离心机。 8.1.3 水浴锅。 8.1.4 荧光 PCR 仪。 8.1.5 微量移液
30、器。 8.1.6 高压灭菌锅。 8.1.7 冰箱（2 4 和 20 ）。 8.2 试剂 8.2.1 水：符合 GB /T 6682 中一级水的规格。 8.2.2 缓冲蛋白胨水（BPW），配制方法见 A.1。 8.2.3 10PCR 缓冲液。 8.2.4 Taq DNA 聚合酶。 8.2.5 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 8.3 引物和探针 根据肠炎沙门菌 ttrBCA 基因序列设计，扩增长度为 95 bp，引物序列为： 上游引物 F ：5- AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC -3 下游引物 R ：5- CTC ACC AGG AGA T
31、TA CAA CAT GG -3 引物纯度为 HPLC 级，用 ddH 2 O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。 探针序列为 FAM CAC CGA CGG CGA GAC CGA CTT T TAMRA。 用 ddH 2 O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。 8.4 质控物质 使用肠炎沙门菌标准菌株（ATCC13 076）作为阳性对照；使用不含沙门菌的组织或培养物作为 阴性对照；用 ddH 2 O 作为空白对照。 8.5 样品采集 同 5.3。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 10 8.6 样品的准备 同 7.6。 8.7DNA 提取
32、同 7.7。 8.8 实时荧光 PCR 扩增 8.8.1 反应体系 反应总体积为 25 L，其中 10PCR 缓冲液 2.5 L、5 U /L Taq DNA 聚合酶 0.5 L、10 mmol /L dNTPs 0.5 L、10 mol/L的引物F和R各1.0 L、10 mol/L 的探针 1.0 L、模板 DNA 2.0 L，补充 ddH 2 O 至 25 L。实时荧光 PCR 扩增可以采用等效的商品化荧光定量 PCR 试剂盒。 8.8.2 反应程序 95 预变性 5 min ；之后 95 变性 15 s，65 退火 30 s，收集荧光，共 40 个循环。同时设阳性 对照、阴性对照和空白对
33、照。 8.9 结果判断 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚 好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择 FAM 通道进行 分析。 阳性对照样品有对数扩增曲线，而且 Ct 值 30 ；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且 Ct 值 40 或未检出，二者均成立才可判定试验成立。 检验样本 Ct 值 35 时，报告沙门菌阳性。 检验样本 35 Ct 值 40 时，重复一次，如果 Ct 值仍然 40，并且曲线有明显的对数增长期， 报告沙门菌阳性；否则报告沙门菌阴性。 样本 Ct 值为零或 Ct 值 40 时，报告未检出沙门菌
34、。 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 11 附录A （ 规范性 ） 试剂的配制 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW） 蛋白胨 10 g 氯化钠 5 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 12H 2 O） 9 g 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ） 1.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.00.2 将各成分加入蒸馏水中，搅拌混匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，121 高压灭菌 15 min。 A.2 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g L- 胱氨酸 0.01 g 蒸馏水 1 000 m
35、L pH 7.00.2 除亚硒酸氢钠和 L- 胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至 55 以下，以无菌 操作加入亚硒酸氢钠和 1 g / L L- 胱氨酸溶液 10 mL（称取 0.1 g L- 胱氨酸，加 1 mol / L 氢氧化钠 溶液 15 mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成，如为 DL- 胱氨酸，用量应加倍）。摇匀 调节 pH。 A.3 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 A.3.1 基础液 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 3.0 g 碳酸钙 45.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.00.2 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解
36、，再加入碳酸钙，调节 pH，121 高压灭菌 20 min。 A.3.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠（含 5 个结晶水） 50.0 g 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 12 蒸馏水 加至 100 mL 121 高压灭菌 20 min。 A.3.3 碘溶液 碘片 20.0 g 碘化钾 25.0 g 蒸馏水 加至 100 mL 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻璃瓶至碘片全部溶解为止，然后加 蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。 A.3.4 0.5煌绿水溶液 煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 mL 溶解后，存放暗处，不少于 1 d，使其自然灭菌。 A
37、.3.5 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 100 mL 加热煮沸至完全溶解，121 高压灭菌 20 min。 A.3.6 制法 基础液 900 mL 硫代硫酸钠溶液 100 mL 碘溶液 20.0 mL 煌绿水溶液 2.0 mL 牛胆盐溶液 50.0 mL 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另 一种成分。 A.4 亚硫酸铋（BS）琼脂 A.4.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 葡萄糖 5.0 g 硫酸亚铁 0.3 g 磷酸氢二钠 4.0 g 煌绿 0.025 g 或 5.0 g/L 水溶液 5.0 mL 柠檬酸铋铵 2.
38、0 g 亚硫酸钠 6.0 g 琼脂 18.0 g 20 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.5 0.2 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 13 A.4.2 制法 将前 3 种成分加入 300 mL 蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中，琼脂加入 600 mL 蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至 80 左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒 入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节 pH，随即倾入琼 脂液中，混合均
39、匀，冷至 50 55 。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过 48 h 会降 低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。 A.5 Hektoen Enteric（HE）琼脂 A.5.1 成分 蛋白胨 12.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 12.0 g 蔗糖 12.0 g 水杨素 2.0 g 胆盐 20.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 18.0 g 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL 0.4溴麝香草酚蓝溶液 16.0 mL Andrade 指示剂 20.0 mL 甲液 20.0 mL 乙液
40、 20.0 mL pH 7.50.2 A.5.2 制法 将前面 7 种成分溶解于 400 mL 蒸馏水内作为基础液；将琼脂加入于 600 mL 蒸馏水内。然后分别 搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节 pH 再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷 至 50 55 倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。 甲液的配制。 硫代硫酸钠 34.0 g 柠檬酸铁铵 4.0 g 蒸馏水 100 mL 乙液的配制。 去氧胆酸钠 10.0 g 蒸馏水 100 mL Andrade 指示剂。 酸性复红 0.5 g 1 mol/L 氢氧化钠溶液 16.0 m
41、L 蒸馏水 100 mL 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 14 将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液 1 mL 2 mL。 A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 A.6.1 成分 酵母膏 3.0 g L- 赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.40.2 A.6.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮
42、沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 55 倾注平皿。 注： 本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于 当天制备，第二天使用。 A.7 胆硫乳（DHL）琼脂 A.7.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉浸膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 去氧胆酸钠 1.0 g 硫代硫酸钠 2.3 g 柠檬酸钠 1.0 g 柠檬酸铁铵 1.0 g 中性红 1.0 g 琼脂 18.0 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.3 以正式出版文本为准
43、 SN/T 51852020 15 A.7.2 制法 将除中性红和琼脂以外的成分溶解于 400 mL 蒸馏水中，校正 pH，再将琼脂于 600 mL 蒸馏水中 煮沸溶解，两液合并，加入 0.5% 中性红溶液 6 mL，冷却至 50 55 ，倾注平皿。 A.8 营养琼脂 营养琼脂干粉 28.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.0 将上述成分煮沸溶解，校正 pH，分装至小试管中，121 高压灭菌 15 min 后，置成斜面，冷藏 备用。 A.9 三糖铁（TSI）琼脂 A.9.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸
44、亚铁铵（含 6 个结晶水） 0.2 g 酚红 0.025 g 或 5.0 g /L 溶液 5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼脂 12.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.40.2 A.9.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管 2 mL 4 mL，121 高压灭菌 10 min 或 115 高压灭菌 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。 A.10 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.10.1 成分 蛋白胨
45、 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1 000 mL 1.6溴甲酚紫 - 乙醇溶液 1.0 mL 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 16 L- 赖氨酸或 DL- 赖氨酸 0.5 g/100 mL 或 1.0 g /100 mL pH 6.80.2 A.10.2 制法 除赖氨酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。L- 赖氨酸按 0.5加入， DL- 赖氨酸按 1加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL， 上面滴加一层液体石蜡，115 高压灭菌 10 min。 A.10.3 试验方法 从琼脂
46、斜面上挑取培养物接种，于 36 1 培养 18 h 24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性 者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应 为黄色。 A.11 蛋白胨水、靛基质试剂 A.11.1 蛋白胨水 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.40.2 将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH，分装小试管，121 高压灭菌 15 min。 A.11.2 靛基质试剂 A.11.2.1 柯凡克试剂：将 5 g 对二甲氨基甲醛溶解于 75 mL 戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸 25 mL。 A.11.2.2
47、 欧 - 波试剂：将 1 g 对二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸 20 mL。 A.11.3 试验方法 挑取小量培养物接种，在 36 1 培养 1 d 2 d，必要时可培养 4 d 5 d。加入柯凡克试剂约 0.5 mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧 - 波试剂约 0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培 养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。 注： 蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。 A.12 尿素琼脂（pH 7.2） A.12.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二氢钾
48、2.0 g 0.4酚红 3.0 mL 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL 20% 尿素溶液 100 mL 以正式出版文本为准 SN/T 51852020 17 pH 7.20.2 A.12.2 制法 除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。 将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121 高压灭菌 15 min。冷至 50 55 ， 加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为 2。分装于无菌试管内，放成斜面备用。 A.12.3 试验方法 挑取琼脂培养物接种，在 36 1 培养 24 h，观
49、察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基 变为红色。 A.13 氰化钾（KCN）培养基 A.13.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 0.225 g 磷酸氢二钠 5.64 g 蒸馏水 1 000 mL 0.5氰化钾 20.0 mL A.13.2 制法 将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后 121 高压灭菌 15 min。放在冰箱内使 其充分冷却。每 100 mL 培养基加入 0.5氰化钾溶液 2.0 mL（最后浓度为 1 ： 10 000），分装于无菌 试管内，每管约 4 mL，立刻用无菌橡皮塞塞紧，放在 4 冰箱内，至少可保存 2 个月。同时，将不 加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。 A.13.3 试验方法 将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取 1 环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑 取1 环接种于对照培养基。在36
