1、 ICS 07.060 CCS A 45 山东省 地方 标准 DB37/T 4298 2020 37 绿潮次生毒性的快速检测方法 发光细菌 法 Rapid determination for secondary toxicity of green tide Luminescent bacteria method 2020 - 12 - 30 发布 2021 - 01 - 30 实施 山东省 市场监督管理局 发 布 DB37/T 4298 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉
2、及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 山东省海洋局 提出 并 组织实施 。 本文件由 山东省海洋标准化技术委员会 归口。 本文件起草单位： 山东省海洋资源与环境研究院 、山东省标准化研究院 。 本文件主要起草人： 宋秀凯、付萍、张秀珍、刘晓波、刘爱英、姜会超、何健龙、程玲、于广磊 、 杨沣江 。 DB37/T 4298 2020 1 绿潮次生毒性的快速检测方法 发光细菌法 1 范围 本 文件 规定了以一种发光细菌 -费氏弧菌（ Vibrio fischeri）为受试生物的绿潮次生毒性快速检测 与毒性水平评价 方法 。 本 文件 适用于绿潮发生海域绿潮藻腐烂液次生毒性的检测。
3、 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 绿潮次生毒性 secondary toxicity of green tide 绿潮藻腐烂分解产生的物质对生态环境产 生的影响及损害的能力。 3.2 光抑制率 light inhibition rate 水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量降低的百分比。 3.3 光增益率 light gain rate 水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量增加的百分比。 3.4 半数效应浓度 median effect concentration 样品在一定的时间
4、和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量减少 50 %时的样品浓度。 3.5 水合 reconstitution 处于冷藏环境的发光细菌冻干粉加入一定量的稀释剂恢复至活性。 3.6 水合时间 reconstitution time 添加稀释剂的发光细菌恢复至活性所需要的时间。 3.7 反应时间 reaction time 恢复至活性的发光细菌与对照样本或者待测样本接触的时间。 4 方法原理 DB37/T 4298 2020 2 发光细菌在一定实验条件下的发光强度是稳定的。在一定绿潮次生污染物范围内，发光细 菌接触样 品后的发光强度与样品的急性毒性水平呈显著负相关（ P 0.05），通过分析仪
5、测定细菌发光强度的变 化以表示样品的急性毒性水平。 5 试剂与材料 5.1 发光细菌冻干粉 本 文件使用的发光细菌菌株为费氏弧菌（ Vibrio fischeri NRRL B-11177）。冻干粉应在 -20 -25 储存， 4 时，保存时间不超过 4周； 22 时，不超过 24 h。 5.2 稀释剂 稀释剂为 2 %氯化钠溶液，用作水合发光细菌冻干粉、稀释样品以及无毒对照样本。 2 8 保存。 宜选用与冻干粉相应的稀释剂。 5.3 参比毒物母液 称取 0.05 g七水合硫酸锌（ ZnSO47H2O、分析纯）溶解于稀释剂中，定容至 500 mL，即为参比毒物母 液（ 100 mg/L）。母液
6、密封 4 保存，保存期不超过 6个月。 5.4 参比毒物标准液 按照等差、等比倍数相结合的方式，采用梯度稀释法将参比毒物母液依次稀释至 6 mg/L、 4 mg/L、 2 mg/L、 1 mg/L、 0.5 mg/L和 0.25 mg/L，用于测定发光强度并制作标准曲线。标准液应现用现配。 6 仪器设备 仪器和设备如下： 生物毒 性分析仪； 温度计 ： 5 +40 ； 离心机 ： 5 000 r/min； 电子天平 ：感量 0.00 1 g。 7 样品的采 集、保存和预处理 7.1 样品的采集 参照 GB 17378.3的规定， 溶解氧、生化需氧量样品采集时应防止搅动水体，水样不应 曝 气。避
7、免采 集漂浮物，水样充满样 品瓶，并记录当时现场的水温。样品瓶采用经过灭菌的 50 mL棕色 玻璃瓶。样品 信息采集表参见附录 A。 7.2 样品的保存 样品采集后宜在现场尽快进行毒性测定。若在实验室内测定，样品 4 保存， 24 h内测定；不能在 24 h内测定的，转入 50 mL冻存管内，于 -20 避光保存， 1周内测定。 7.3 样品的预处理 DB37/T 4298 2020 3 浑浊的样品应通过沉淀或使用离心机以 5 000 r/min，离心 1 min后，取上清液进行毒性测试。 8 样品的检测 8.1 实验室温度的校正 实验室检测时，调节室内温度与采样地温度接近。温差控制在 2 。
8、 8.2 样品管的准备 根据样品数量，准备相应数量的测试管：对照样品管 2 3个（ 3个重复），待测样品管 2 n 3个 (n: 样品数量 )。将测试管在小试管架中平均排成两排，第一排编码为 A1、 A2、 A3 An；第二排编码为 B1、 B2、 B3 Bn，前后两排一一对应。 注： n应小于 10。 8.3 发光细菌冻干粉的水合 根据待测样品的数量，从冷冻 环境中取出相应数量的发光细菌冻干粉，轻敲小瓶，确保冻干细菌充 分落在瓶子底部。加入稀释剂，水合时间 15 min。若水合单瓶冻干粉，向每只冻干粉中添加 300 L稀释 剂，用调至 100 L的移液器混合 3 4次；若水合多瓶冻干粉，需向
9、每支冻干粉中加入 300 L稀释液， 然后将所有水合试剂并入一个新试管中，用调至 500 L的移液器混合 3 4次。在等待水合过程中，可 将稀释剂、待测水样各取 1 000 L分别加入 A1管及 A2 An管中。 8.4 发光细菌初始相对发光值的测定 冻干粉水合 15 min之后，水合液由浑浊变为清澈。依次向 B1、 B2、 B3 Bn小试管中添加 100 L水 合液，并依次将 B1 Bn放入检测仪中进行初始相对发光值检测。 8.5 反应后发光细菌相对发光强度值测定 当第 Bn个小试管读数结束放回试管架后， 5 min反应时间倒计时开始，迅速取 A列溶液 900 L加到对 应的 B列小试管中，
10、混匀。待反应结束后，依次对 B1、 B2、 B3 Bn发光值读数。 9 标准液检测 测定同一批样品或开始使用一批新的发光菌冻干粉试剂时均需进行毒性测定。测试步骤同 8。 10 数据处理 10.1 光抑制率 /光增益率的计算 光抑制率 /光增益率 I计算方法见公式 (1)： = 100% (1) 式中： So 测试样品管初始 相对发光强度值； St 测试样品管反应 5 min后相对发光强度值； f 反应 5 min校正因子，计算方法见公式 (2)： DB37/T 4298 2020 4 = (2) 式中： Co 对照样品管初始相对发光强度值； Ct 对照样品管反应 5 min后相对发光强度值。
11、10.2 EC50的计算 以 I值为横坐标， ZnSO47H2O浓度为纵坐标做对数趋势线预测，得出相关系数 R并计算出 EC50。 11 质量控制 样品检测时应注意： 反应 5 min 校正因子 f 应为 0.6 1.8，否则更换冻干粉； 15 35 ，反应 5 min 标准液 ZnSO47H2O 的 EC50范围为 1 mg/L 10 mg/L。 12 毒性水平评价 样品毒性水平的表征方法采用反应 5 min发光抑制 /增益率 I进行评价。具体评价方法为： 根据 I值将毒性等级分为 4级， 1、 2、 3、 4级分别为无毒性风险、低度毒性风险、中度毒性风险、高 度毒性风险，分级方法 见表 1
12、。测试结果报表参见附录 B。 表 1 毒性风险等级评价方法 毒性等级 I 毒性风险等级 1 I 0 无毒性风险 2 0 I 30 % 低度毒性风险 3 30 % I 80 % 中度毒性风险 4 I80 % 高度毒性风险 DB37/T 4298 2020 5 A A 附录 A （资料性） 样品信息采集表 样品信息采集表见表 A.1。 表 A.1 样品信息采集表 监测单位： （章） 填表日期： 年 月 日 共 页 第 页 采样者 发光菌、仪器名称 样品编号 采样时间 经度 纬度 水温 保存方式 运输方式 分析者 校对者 审核者 DB37/T 4298 2020 6 B B 附录 B （资料性） 测试结果报表 测试结果报表见表 B.1。 表 B.1 测试结果报表 监测单位： （章） 填表日期： 年 月 日 共 页 第 页 检测时间 检测时温度 校正因子 f 参比毒物 标准液检测 ZnSO47H2O mg/L I % I 均值 % 线性回归方程 相关系数 R EC50 样品检测 样品编号 温差 是否离心 I % I 均值 % 毒性等级 分析者 校对者 审核者 DB37/T 4298 2020 7 参考文 献 1 GB 17378.3 海洋监测规范 第 3部分：样品采集、贮存与运输
