1、 ICS 07.100 B 50 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4092 2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 The general technical requirements of separation and identification of fish intestinal microorganism 2020 - 08 - 20 发布 2020 - 09 - 20 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4092 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省海洋局提出并组织实施。 本标准由山东省海洋标准化技
2、术委员会归口。 本标准负责起草单位：青岛华大基因研究院、青岛市标准化研究院。 本标准主要起草人：刘姗姗、乔雪松、王裕宽、王萌萌、杨 恒加、王琛、陈建威、苏小珊、翟越、 许静、赵丹。 DB37/T 4092 2020 1 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求 1 范围 本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。 本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要
3、求 GB/T 30744 深海微生物样品前处理技术规范 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏 技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肠道微生物 intestinal microorganism 生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。 3.2 16S rDNA 是编码 16S rRNA的基因， 16S rRNA为核糖体 RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签， 可被用于菌种鉴定。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种分子生物学技术，用于扩增特定的 DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行
4、，不必依赖大肠 杆菌或酵母菌等生物体。 3.4 Sanger测序 Sanger sequencing 即双脱氧链终止法测序，为第一代 DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于 DNA分析，由英 国生物化学家弗雷德里克桑格于 1977年发明。 4 缩略语 DB37/T 4092 2020 2 下列缩略语适用于本文件。 PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffer Saline） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction） OD：光密度（ Optical Density） 5 基本要求 5.1 实验室通用要求 实验室应满足 GB 19489中关
5、于一级或以上级别生物安全实验 室的要求。 5.2 鱼类样本要求 鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过 24 h。 5.3 实验用具准备 一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌 PBS（配方见附录 A.1）、 2216E培养基 (配方见附 录 A.2)、 LB培养基（配方见附录 A.3）、无菌水、无菌 50 mL离心管、医用托盘、 75 %消毒酒精、涂布棒 等。 6 鱼类肠道微生物样本采集和保存 6.1 鱼类肠道微生物样本采集与储存 6.1.1 活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用 75 %的酒精对鱼体擦拭消毒。 6.1.2 将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开
6、，用无菌 PBS冲洗鱼 类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。 6.1.3 分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于 离心管中。 6.1.4 对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在 10 g以下，按 1 g内容物加入 3 mL无菌 PBS的 比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。 6.2 肠道微生物样本存储 肠道微生物样本应储存在 2 8 低温环境下，宜立即进行处理，保存期限不应超过一周。 7 鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定 7.1 肠道微生物分离和纯化 7.1.1 肠道微生物分离 7.1.1.1 取 100 L肠道微生物样本，用无菌 PBS稀释
7、到 1 000 L，制成 10-1样品稀释液，震荡混匀， 备用。 7.1.1.2 取 100 L 10-1样品稀释液，用无菌 PBS稀释到 1 000 L，制成 10-2样品稀释液，震荡混匀， 备用。 7.1.1.3 按上述步骤依次稀释获得 10-3、 10-4的样品稀释液，震荡混匀，备用。 DB37/T 4092 2020 3 7.1.1.4 取 10-2， 10-3， 10-4样品稀释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜 28 恒温培养，培养时 间 1 3天，每隔 12 h观察菌落生长状态。 7.1.2 肠道微生物纯化 7.1.2.1 观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（
8、约 10 200 个菌落）的平板挑 选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线， 于 28 恒温培养 12 h 24 h。 7.1.2.2 观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养， 直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写菌落形态特征统计表，参见附录 B。 7.2 肠道微生物培养 挑取分离、纯化出的纯培养单菌落接种至液体培养基中，宜 150 rpm 28 条件下恒温震荡培养至菌 液 OD 600值达到 0.6 1.0之间。 7.3 肠道微生物鉴定 7.3.1 微生物基因组提取 对培养得到的菌液进行基因组提取，参照 GB/T 30744内相关内容进行。
9、7.3.2 基因组 16S rDNA 基因扩增 对所提取菌 株基因组的 16S rDNA基因进行 PCR扩增， 扩增引物及反应条件详见附录 C。 7.3.3 PCR 产物电泳检测 对扩增所得 PCR产物进行电泳检测，步骤参见附录 D。 7.3.4 PCR 产物测序及序列比对 对检测合格的 PCR产物进行 Sanger测序，测序结果与 EzBioCloud数据库进行序列比对，确定分离微 生物的种类并参考附录 E的信息记录表进行记录。 7.3.5 其他情况 对于测序比对没有结果的菌株，可进行生化鉴定，包括镜检、革兰氏染色、接触酶试验、氧化酶试 验等，根据实验结果鉴定菌株种属类别。 8 鱼类肠道微生
10、物的保藏 8.1 肠道微生物保藏 菌种保藏参见 SN/T 2632规范内容。 8.2 保藏微生物信息记录 参照附录 E的信息记录表，对保藏信息进行记录。 DB37/T 4092 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 缓冲液及培养基配方 表 A.1给出 PBS配方。 表 A.1 PBS 配方 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g 蒸馏水 定容至 1 000 mL pH 值 7.4 表 A.2给出 2216E培养基配方。 表 A.2 2216E 培养基配方 蛋白胨 5 g 酵母膏 1 g FePO4 0.01 g 陈海水 定容至
11、 1 000 mL 琼脂糖（固体培 养基添加） 15 g pH 值 7.6 注： 适用海水鱼肠道微生物培养 表 A.3给出 LB培养基配方。 表 A.3 LB 培养基配方 蛋白胨 10 g 酵母膏 5 g NaCl 10 g 蒸馏水 定容至 1 000 mL 琼脂糖（固体培养基添加） 15 g pH 值 7.6 注： 适用淡水鱼肠道微生物培养 DB37/T 4092 2020 5 B B 附 录 B （规范性附录） 菌落形态特征统计表 表 B.1给出菌落形态特征统计表。 表 B.1 菌落形态特征统计表 菌种编号 颜色 大小 形状 质地 有无晕圈 有无光泽 是否湿润 是否凸起 是否透明 培养时间
12、 记录人 DB37/T 4092 2020 6 C C 附 录 C （规范性附录） 菌液 PCR 表 C.1给出 PCR反应引物序列。 表 C.1 PCR 反应引物序列 引物名称 序 列 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGCTACCTTGTTACGACTT 表 C.2给出 PCR反应体系。 表 C.2 PCR 反应体系（ 25 L） 组分 用量 L 无菌水 17.2 10 PCR Buffer 2.5 dNTP 2.0 27F 1.0 1492R 1.0 Taq 酶 0.3 模板（菌液） 1.0 表 C.3给出 PCR反应时间。 表 C.3 PCR 反应时
13、间 温度 时间 循环 94 5 min 1 个循环 94 30 s 30 个循环 55 1 min 72 1 min 72 10 min 1 个循环 4 1 个循环 DB37/T 4092 2020 7 D D 附 录 D （规范性附录） 电泳测试 D.1 材料准备 Loading buffer，纯化 PCR样品， DL2000 Marker，琼脂糖， TAE缓冲液， SYBR Safe染料，凝胶托盘， 电泳槽，凝胶用梳子。 D.2 电泳检测 配制 1.5 %浓度（ w/v）琼脂糖凝胶（小托盘一般需 30 mL，中托盘需 50 mL，大托盘需 100 mL），以 4 L/100 mL的量加入
14、SYBR Safe染料。吸取 Loading buffer、纯化 PCR样品各 2 L，混匀。待凝胶冷却后， 放入电泳槽。各梳孔内加入 3 L混合样品，加入 3 L Marker，接通电源，调节电压至 120 V 200 V进 行跑凝胶电泳。 D.3 凝胶成像 将凝胶电泳放入凝胶成像仪成像观察。 D.4 产物验证 观察电泳条带是否单一、条带是否明亮、产物大小是否为 1 500 bp左右， 若满足上述要求，则表明 PCR成功。对于没有成功的样品可再次进行 PCR验证，或将保藏的菌液进行活化，培养后再次进行 PCR。 DB37/T 4092 2020 8 E E 附 录 E （规范性附录） 菌株信
15、息记录表 表 E.1给出菌株信息记录表。 表 E.1 菌株信息记录表 鱼种信 息 鱼种 鱼编号 采集日期 获取方式 采集地点 样品状态 保藏人 备注 菌 株 16S rDNA鉴定 及保藏信息 菌株编号 Top-hit taxon Top-hit strain Similarity % 保藏时间 保藏方式 保藏孔位 注： 鱼种编号和菌株编号可根据自身需要进行编制，如 ： AK1（ 1号鮟 鱇鱼）， 2018-AK1-G-001（ 1号 鮟鱇鱼肠道第 一株菌）。 DB37/T 4092 2020 9 参 考 文 献 1 中国科学院微生物研究所 . 菌种保藏手册 M. 北京：科学出版社， 1980.
16、 2 张美玲 , 杜震宇 . 水生动物肠道微生物研究进展 J. 华东师范大学学报 (自然科学版 ), 2016, 2016(1):1-8. 3 Roeselers G, Mittge E K, Stephens W Z, et al. Evidence for a core gut microbiota in the zebrafishJ. Isme Journal, 2011, 5(10):1595. 4 Li X, Yu Y, Feng W, et al. Host species as a strong determinant of the intestinal microbiota o
17、f fish larvae.J. Journal of Microbiology, 2012, 50(1):29-37. 5 张涵 , 周涛 , 王岩 . 综合养殖池塘中三角帆蚌和鱼类肠道细菌的组成 J. 水生生物学报 , 2013(5):824-835. 6 邢孟欣 , 李贵阳 , 侯战辉 ,等 . 不同大菱鲆 (Scophthalmus maximus)个体肠道菌群结构差异研 究 J. 现代生物医学进展 , 2014, 14(20):3801-3805. 7 王纯 , 倪加加 , 颜庆云 ,等 . 草鱼与团头鲂肠道菌群结构比较分析 J. 水生生物学报 , 2014(5):868-875.
18、8 Sanchez L M, Weng R W, Riener R M, et al. Examining the Fish Microbiome: Vertebrate-Derived Bacteria as an Environmental Niche for the Discovery of Unique Marine Natural ProductsJ. Plos One, 2012, 7(5):e35398. 9 Dong B, Yi Y, Liang L, et al. High Throughput Identification of Antimicrobial Peptides
19、 from Fish Gastrointestinal Microbiota.J. Toxins, 2017, 9(9):266. 10 张晓华 . 海洋微生物学 M. 中国海洋大学出版社 , 2007. 11 中华人民共和国国务院 . 医疗废物管理条例 J. 中华人民共和国国务院公报 , 2003, 3(21):5-10. 12 孟庆闻 . 鱼类学实验指导 M. 中国农业出版社 , 1995. 13 周德庆 . 微生物学实验手册 M. 上海科学技术出版社 , 1986. 14 Robert F.Weaver. 分子生物学 = Molecular Biology : 第 3版 : 英文 M. 科学出版社 , 2008. 15 国家微生物资源平台 . 微生物菌种资源收集整理、保藏技术规程汇编 M. 北京：中国农业科 学技术出版社， 2011. _
