1、 ICS 65.020.01 CCS B 16 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3378 2021 辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程 Technical regulation on quarantine for the pine wilt disease in Liaoning province 2021 - 01 - 30 发布 2021 - 03 - 02 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3378 2021 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 取样 . 2 5 形态学鉴定 . 2 7 样品监管
2、 . 3 8 检验鉴定 结果反馈及疫情上报 . 3 附录 A（资料 性 ） 松材线虫形态特征 . 5 附录 B（资料 性 ） 松材线虫病取样 . 6 附录 C（资料 性 ） 常用的松材线虫分离 方法 . 8 附录 D（资料 性 ） 临时玻片制作和线虫快速培养 . 10 附录 E（资料 性 ） 松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别 . 11 附录 F（规范性 ） 松材线虫形态学检验鉴定记录表 . 12 附录 G（资料 性 ） 分子生物学鉴定 . 13 附录 H（规范性 ） 松材线虫分子生 物学检验送检表 . 16 附录 I（规范性 ） 松材线虫检验鉴定报告 . 17 DB21/T 3378 2
3、021 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1给出的规则编写。 本标准由辽宁省林业和草原局提出并归口管理。 本标准起草单位：辽宁省林业发展服务中心（辽宁省林业和草原有害生物防治检疫工作站）、辽宁 省危险性林业有害生物防控重点实验室。 本标准主要起草人：姜生伟、葛芳、崔雪、吴昊、杨庆寅、焦大志、秦一航、舒红、张佩洁、孙龙 生、董蔚、肖艳、冯世强、孟照煜、郭斌、张艳春、王焱冰、李菊、柴晓东、郑雅楠、刘佩璇、陈海明、 郑英明、刘佳、张霞、杜岳纯、裴明阳、雷鸣雷。 本标准发布实施后 ， 任何单位和个人如有问题和意见建议 ， 均可以通过来电和来函等 方式进行反馈 ， 我们将及时答复并认真处理 ， 根
4、据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（沈阳市和平区太原北街 2号） ， 联系电话： 024-23448927。 标准起草单位通讯地址：辽宁省林业发展服务中心（辽宁省林业和草原有害生物防治检疫工作站） （沈阳市和平区太原北街 2号综合楼 B-621） ， 联系电话： 024-23447935。 DB21/T 3378 2021 1 辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了松材线虫病取样、检验鉴定、样品监管、检验鉴定结果反馈 及 疫情上报的相关技术和 流程。 本标准适用于松材线虫寄主植物及其制品检验鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过
5、文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件 ， 其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 23476 松材线虫病检疫技术规程 GB/T 23478 松材线虫普查监测技术规程 GB/T 35342 松材线虫分子检测鉴定技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus （ Steiner et Buhrer） Nickle 属于线虫门（ Nematoda） ， 侧尾腺纲（ Secernentea） ， 滑刃目（ Aphele
6、nchida） ， 滑刃总科 （ Aphelenchoidoidea） ， 滑刃科（ Aphelenchoidoidae） ， 伞滑亚科（ Bursaphelenchinae） ， 伞滑刃属 （ Bursaphelenchus）。其形态特征参见附录 A。 3.2 松材线虫病 由松材线虫寄生在松树体内引起松树迅速死亡的一种毁灭性林木病害，又称松树萎蔫病、松材线虫 萎蔫病、松树枯萎病。 3.3 松木及其制品 松科原木、锯材和用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料。如电缆盘、光缆盘、木板 箱、木托盘、垫木、枕木、衬木等。 经人工合成或经加热、加压等深度加工的包装木质材料除外，如胶合板、纤维板
7、等。 3.4 DB21/T 3378 2021 2 检验鉴定 对松科植物及其制品，通过形态学特征或分子省物学特性检验判定是否含有松材线虫的过程。 3.5 样品 从表现出异常症状的松科植物或松木制品上选取的，用于松材线虫病检验鉴定的材料。 4 取样 4.1 感病松树现地取样方法 适用于春秋季普查和日常监测中发现的异常松树。春季普查在 4 月 -6 月份 ， 秋季普查在 8 月 -11 月 份。具体取样方法参见附录 B.2。 4.1.1 感病松树典型症状 感病松树在新发生林分内呈零星点状分布，多为林分中的优势木，后发展为以定居点为中心，随机 向外扩散。远看松针颜色为褐色或亮红褐色，枯死枝条从树冠向
8、下逐渐增多，针叶不脱落。 4.1.2 感 病松树病症表现时间 当年染病的松树一般在 8 月下旬至 11 月上旬表现病症，越年死亡的一般在 4 月 -6 月表现病症。 4.2 松木及其制品取样方法 直接观察或借助锯、斧等工具检查松木及制品是否干枯；重量是否明显减轻；木质部是否有蓝变； 松脂味是否消失；有无媒介昆虫危害、补充营养取食的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。 取样 对象、取 样部位和数量参 见附录 B.3。 5 形态学鉴定 5.1 分离 采用贝尔曼漏斗法、 浅盘法进行（参见附录 C）。分离时间一般需要 4h-12h。将分离液体收集到试 管或者烧杯中，通过自然沉淀或使用离心机处理后得到线虫分离
9、液。 5.2 镜检 将盛有线虫分离液的培养皿置 于解剖镜下观察 ， 先确认有无线虫。对有线虫的样品进行活体检验 ， 观察它的一般形态结构 ， 选出特征明显的成虫 ， 用胶头吸管或移液枪移至载玻片上热杀死并制作临时玻 片 ， 再根据形态特征予以鉴别。 （ 参见附录 D） 5.3 培养 当分离的线虫为幼虫或雌、雄成虫数量极少时 ， 可以采用疫木保温保湿或真菌活体培养法快速培养 松材线虫。（参见附录 D） 5.4 形态特征 DB21/T 3378 2021 3 根据松材线虫的形态特征、松材线虫和拟松材线虫形态特征主要区别（参见附录 E）进行鉴定 ， 一 般先观察线虫中的食道球形状、口针有无及口针的形
10、状 ， 再对其典型形态特征观察和 测计后才能确定。 5.5 检验记录 检验鉴定结果填入松材线虫形态学检验鉴定记录表（参见附录 F）。 6 分子生物学鉴定 常用的分子生物学鉴定方法有松材线虫 PCR检测、松材线虫自动化分子检测和实时荧光 PCR检测。 （参见附录 G） 7 样品监管 7.1 样品保存 送检样品应及时做分离检测 ， 分别保存 ， 避免交叉污染。将样品装入塑料袋内 ， 在袋上扎少量小孔 （木段或圆盘可直接保存） ， 保持样品湿润。标明样品信息（送检单位、样品编号、送检时间等）放入 4 恒温箱 ， 一般在 1个月内完成分离检验。 检验鉴定的样品保存不少于 6个月 ， 以备复检。 7.2
11、 分子生物学检验 样品送检 样品送检时有条件的要先经过初步镜检 ， 镜检后出具初步检验鉴定报告和松材线虫形态学检验鉴定 记录表 ， 并填写松材线虫分子生物学检验送检表（附录 H） ， 报送省级检验鉴定机构登记检验。 送检要有专人负责 ， 保证样品送检安全 ， 不能通过邮寄方式。 7.3 样品销毁 分离检验后的样品要采用高压灭菌、焚烧、粉碎的方式及时销毁处理。 8 检验鉴定结果反馈及疫情上报 8.1 检验鉴定结果反馈 省级检验鉴定机构应当在收到送检样品 10个工作日内出具检验鉴定报告 ，（ 报告样式参见附录 I） 并留档备查。 8.2 检验鉴定结果确认 检验鉴定结果可能为新增松材线虫病疫区和疫点
12、时 ， 省级检验鉴定机构应当在检验鉴定后 3个工作 日内 ， 将结果报送至省林业和草原行政主管部门所属的防治检疫机构 ， 由其组织相关检验鉴定机构进行 二次确认 ， 确认后反馈至送检单位。 8.3 检验鉴定备案 省级检验鉴定机构每半年需将检验鉴定开展情况上报省林业和草原行政主管部门所属的防治检疫 机构备案。市、县送检的检验鉴定记录、报告等档案要保存 3年以上。 DB21/T 3378 2021 4 8.4 疫情上报 松材线虫病疫情一经确认 ， 市、县林业和草原行政主管部门应在规定时间内同时报告上级林业和草 原行政主管部门及当地人民政府。 8.5 疫情信息发布 国家和省级林业和草原行政主管部门按
13、照有关规定发布疫情信息。 DB21/T 3378 2021 5 A A 附 录 A （资料性） 松材线虫形态特征 松材线虫的雌、雄虫都呈蠕虫形 ， 虫体细长。唇区高 ， 缢缩明显 ， 前缘圆。口针细长 ， 中食道球卵 圆形 ， 占体宽的 2/3以上。雌虫阴门宽 ， 上阴唇长 ， 向下覆盖。尾部末端近圆柱形 ， 尾端椭圆或尾尖突 ， 尾尖突长 1m左右 ， 不超过 2m。 雄虫交合刺大 ， 呈弓形 ， 成对 ， 交合刺末端膨大尖突。尾部末端尖 ， 侧面向腹弯曲呈爪状 ， 端部包 裹卵形交合伞。 雌虫： A.整体； F.体前部； G.阴门区； H-J.尾部 雄虫： B.整体； C.尾部； D.尾端
14、； E.交合刺 DB21/T 3378 2021 6 B B 附 录 B （资料性） 松材线虫病取样 B.1 取样工具 电锯或手锯 、 砍刀或斧头 、 手摇钻 、 标签 、 塑封袋 。 B.2 现地取样方法 B.2.1 取样对象 优先抽取尚未完全枯死或刚枯死的松树。可参照以下特征选择取样松树： （ 1）对发现的枯死、濒死松树首先排除其它死亡原因（干旱、人畜破坏、森林火灾、冻害、水渍、 其它病虫危害）； （ 2）针叶呈现红褐色、黄褐色； （ 3）整株或部分枝条萎蔫、枯死 ， 但针叶下垂、不脱落； （ 4）树干部有媒介昆虫的产卵刻槽或侵入孔； （ 5）树干部松脂渗出少或无松脂渗出。 B.2.2 取
15、样数量 以小班为单位 ， 表现有取样特征的松树在 10株以下全部取样； 10株以上的先抽取 10株进行取样检验 ， 如果检验有则不需要继续取样 ， 如果没有要继续取样检验 ， 直至全部取样检验为止。 B.2.3 取样部位 优先在表现症状明显的枝条上取样。对树干取样时 ， 一般在树干下部（胸高部位）、中部（上、下 部之间）、上部（主干与主侧枝交界处） 3个部位取样。对于仅部分枝条表现症状的 ， 在其表现症状的 枝条上取样。对于树干内发现媒介昆虫蛹的 ， 优先在蛹室周围取样。 B.2.4 取样方法 在取样部位剥净树皮，用砍刀或斧头直接砍取 100g-200g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部表 面
16、至 髓心钻取 100g-200g木屑；或者将枯死松树伐倒，在取样部位分别截取 2cm厚的圆盘等。 B.2.5 样品标记 所取样品要及时贴上标签，标明样品编号、取样地点、林班、小班、树种、树龄、取样部位、取样 时间和取样人等信息。 B.3 松木及其制品取样方法 B.3.1 取样对象 DB21/T 3378 2021 7 选择截面无松脂痕迹、密度明显减轻或木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室的松木及其制 品进行取样。 B.3.2 取样部位和数量 原木取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取 100g-200g木片；或用手摇钻从木质部至髓心钻取 100g-200g木屑；或分别截取 2cm厚的圆盘。松木
17、制品进行取样时可直接砍取 100g-200g木片；或直接带 回部分松木制品。 B.3.3 样品标记 所取样品要及时贴上标签，标明样品编号、取样地点、松木制品名称、取样时间和取样人等信息。 DB21/T 3378 2021 8 C C 附 录 C （资料性） 常用的松材线虫分离方法 C.1 贝尔曼漏斗法 贝尔曼漏斗法是分离线虫的经典方法之一。分离器由漏斗、橡皮管、止水夹、厚面巾纸组成。 (图 C.1) 在口径为 10cm-20cm的漏斗末端接一段 10cm长橡皮管 ， 在橡皮管后端用止水夹夹紧 ， 在漏斗内铺两 层大小适中的面巾纸。 将样品去皮后劈成长约 1cm-4cm， 直径 1cm-3cm
18、的细条或直接取木屑约 10g置 于漏斗中的面巾纸 ， 用面巾纸包好 ， 加水至浸没样品。注入水后要注意使水充满漏斗和下面的橡皮管 ， 橡皮管内不得有气泡 ， 如果有气泡可以松开止水夹放出一些水 ， 冲掉气泡。室温不低于 20 ， 分离浸泡用的水温在 20 -30 之间 ， 线虫游离出一定数量后可镜检 ， 一般需要 3h-12h。 要轻轻打开止水夹 ， 用培养皿或烧杯在橡皮管下接取分离液约 10ml；或用离心沉淀管接取分离液 5ml， 自然沉淀 30min或 1500/min离心 2min。 C.2 浅盘法 浅盘分离器主要由浅盘和筛盘组成 ， 其中口径略小的底 部为网筛状 ， 放在另一个浅盘里面
19、。将两层 湿纱布铺于筛盘上 ， 把样品劈碎（或木屑）置于筛盘的纱布上 ， 慢慢注入清水 ， 没过样品。 12h-24h后 ， 将下面浅盘的分离液收集到小烧杯中 ， 自然沉淀 30min或 1500r/min离心 2min。 (图 C.2) 图 C.1 贝尔曼漏斗法装置图 DB21/T 3378 2021 9 图 C.2 浅盘法装置图 DB21/T 3378 2021 10 D D 附 录 D （资料性） 临时玻片制作和线虫快速培养 D.1 临时玻片制作 D.1.1 杀死线虫 将线虫分离液取一滴放在载玻片上 ， 将载玻片在酒精灯火焰上来回 移动 5s-6s， 加热过度会破坏线 虫体内器官或使其表
20、皮熟化变白 ， 影响观察。也可以将线虫分离液放在试管中 ， 把试管放在 60 -65 的水浴箱中 2min-3min， 即可杀死线虫。 D.1.2 玻片制作 在 载玻片上滴一滴水 ， 用挑针或吸管吸一滴线虫悬液在载玻片上 ， 用挑针将线虫轻轻按到水滴底部 ， 以免盖盖玻片时线虫会随水流到盖玻片的边缘 ， 影响观察 。 在盖盖玻片时 ，要从侧面慢放，尽量不产生 气泡。 D.2 线虫快速培养 D.2.1 疫木保温保湿培养 将样品锯成小段 ， 置于烧杯中 ， 加少量清水使木段下端浸在水中 ， 木段上端用湿纱布覆盖 ， 在 26 -30 培养箱内培养 3天 ， 倒取杯中水液 ， 可获得较多成虫。 D.
21、2.2 单异活体培养 制备马铃薯 -葡萄糖 -琼脂（ PDA）培养基平板。通常用于培养松材线虫的真菌为灰葡萄孢（ Botrytis cinerea)或盘多毛孢（ Pestalotia spp.)， 此外用镰刀孢（ Fusarim spp.)培养松材线虫效果亦佳。无菌条件 下将盘多毛孢、镰刀孢或灰葡萄孢接种在 PDA平板上 ， 盘多毛孢或镰刀孢 28 恒温培养 4d-5d， 灰葡萄 孢 25 恒温培养 4-5天 ， 待菌丝长满平板 ， 培养完成后可长期置于 4 冰箱冷藏备用。培养基放置室温后 将线虫接到菌丝上 ， 盘多毛孢、镰刀孢在 30 条件下保湿培养线虫 ， 2天即可分离鉴定。灰葡萄孢在 2
22、5 恒温培养线虫需要 1d-3d。 DB21/T 3378 2021 11 E E 附 录 E （资料性） 松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别 E.1 松材线虫典型形态特征 图 E.1 松材线虫典型形态特征 前体部特征 雄虫尾部弓形 雄虫尾部交合伞 雌虫尾部指形 雌虫尾部短尾尖突 雌虫阴门 E.2 松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别 拟松材线虫 B.muctonatus（ Mamiya et Enda）在形态学和生物学方面都与松材线虫相似 ， 但分布较 松材线虫广泛 ， 在松材线虫病的检验中常常可见 ， 二者在形态上的主要区别在于： (表 E.1) 表 E.1 松材线虫和拟松材线虫形态
23、特征主要区别 类 别 松材线虫 拟松材线虫 雌虫尾部 亚圆锥形末端钝圆 ， 少数可见微小的尾 尖突 ， 不超过 2m， 一般为 1m 圆锥形 ， 末端有明显的尾尖突 ， 长度在 3.5m-5m 雄虫尾部 交合刺远端有盘状突 ， 交合伞为卵形 交合刺远端无盘状突 ， 交合伞为近方形 DB21/T 3378 2021 12 F F 附 录 F （规范性） 松材线虫形态学检验鉴定记录表 表 F.1 松材线虫形态 学检验鉴定记录表 检验单位 ： 日期： 样号 采样地点 天牛栖居痕迹 线虫 松材线虫 检验日期 检验人 注： “采样地点”填写到小班。例如：县镇（林场）林班小班。“天牛栖居痕迹” 填写“有”
24、 或“无”；“线虫” 填写“有”或“无”；“松材线虫” 填写“是”或“否”。 DB21/T 3378 2021 13 G G 附 录 G （资料性） 分子生物学鉴定 G.1 松材线虫 PCR检测 G.1.1 线虫基因组 DNA的提取 制作线虫裂解液 (200mmol/LTris-HC1 、 200mmol/LNaC1 、 100mmol/LEDTA 、 2%SDS 、 2%-mercaptoethanol、 200g/mL蛋白酶 K)， 预冷线虫裂解液 ， 按照 10L线虫裂解液： 1条线虫比例 ， 将 线虫与裂解液置于离心管中。置于 PCR仪 ， 70 条件下保温处理 35min， 在 95
25、 条件下保温处理 10min 后 ， 12000/min离心 2min， 取上清液。 G.1.2 反应体系 每反应的混合液总体积为 20L， 其中： （ 1） 2.0L 10快速 Taq PCR 缓冲液； （ 2） 2L 2.5mmol/L的 dNTP； （ 3） 0.3L快速扩增 Taq酶； （ 4） 1.5L 10mmol/L的引物组合 B； （ 5） 2.0L的模板 DNA； （ 6）补充高压灭菌重蒸水至 20L。 G.1.3 反应程序 反应混合液在 98 预变性 5s， 进入循环 98 变性 3s， 52 退火 3s， 72 延伸 40s， 共 30个循环 ， 最 后 72 延伸 2m
26、in。 G.1.4 结果检测 PCR 扩增产物在 1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳 ， 电泳缓冲液为 1TAE或 1TBE， 电压为 5V/cm， 电泳 时间为 30min。置凝胶于 302nm透射紫外灯上观察 ， 拍照。结果参见 图 G.1。 图 G.1 松材线虫 电泳 检测 图谱 注： 泳道 M-标 准 DNA； 47-49松材线虫； 50-52拟松材线虫 G.2 松材线虫自动化分子检测 DB21/T 3378 2021 14 G.2.1 松材线虫病试剂盒组成成分 名 称 数 量 成 分 DNA 提取试剂 A液 2 ml/管 1管 松材线虫裂解缓冲液 DNA 提取试剂 B液 200l/管 1管
27、 松材线虫消化酶 pCR扩增混合 K液 500l/管 1管 含 Taq DNA聚合酶 ， dNTP的溶液 PCR扩增混合 P液 150l/管 1管 特异性引物、探针 线虫 DNA阳性质控 Y液 75l/管 1管 松材线虫 DNA片段 阴性质控 C液 1ml/管 1管 无酶水 G.2.2 适用设备 松材线虫自动化分子检测系统 48，松材线虫自动化分子检测系统 48A，松材线虫自动化分子检测系 统 mini等松材线虫荧光定量 PCR 检测系统。 G.2.3 检测方法 将分离的线虫置于 1.5mL悬浮液离心浓缩 ， 取底部液体 20L， 加入 A液 20L， B液 2L；金属浴中 65 ， 40mi
28、n， 95 ， 10min； 12000r/min离心 3min， 取上清液（线虫 DNA溶液）。 G.2.4 反应体系 样品：线虫 DNA溶液 3.5L， 加入 K液 5L， P液 1.5L。 阳性对照：线虫 DNA阳性质控 Y液 3.5L， 加入 K液 5L， P液 1.5L。 阴性对照：阴性质控 C液 3.5L， 加入 K液 5L， P液 1.5L。 G.2.5 反应程序 将样品、阳性对照及阴性对照放入机器，选择仪器中松材线虫自动检测程序。 G.2.6 反应结果 松材线虫自动化分子检测系统采用自动程序判读检测结果，如表 G.1、 G.2。 表 G.1 松材线虫自动化分子检测结果 序号 颜
29、色 组别 样品来源 Ct 值 判定结果 1 1 A1 25.83 含松材线虫 2 1 A2 20.23 含松材线虫 3 1 A3 28.47 含松材线虫 4 1 A4 23.19 含松材线虫 5 1 A5 27.38 含松材线虫 6 1 A6 21.28 含松材线虫 7 1 阳性对照 16.65 含松材线虫 8 1 阴性对照 不含松材线虫 DB21/T 3378 2021 15 表 G.2 松材线虫自动化检测结果 G.3 实时荧光 PCR检测 G.3.1 检测仪器 实时荧光 PCR仪、高速冷冻离心机。 G.3.2 引物与探针 松材线虫的引物 正向引物序列： 5 -GAGCAGAAACGCCGA
30、CTT-3 ； 反向引物序列： 5 -CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3 ； TaqMan探针序列： 5 -TGCACGTTGTGACAGTCGT-5 。 G.3.3 反应体系 反应的混合液总体积为 20L ， 其中： TaqMan通用 PCR预混液 10L ； 10mol/L TaqMan 探针 1.0L ； 10mol/L 正向引物 0.5L ； 10mol/L 反向引物 0.5L ； 模板 DNA1.0L ； dd H2O7.0L ； G.3.4 反应程序 反应混合液在 95 预变性 10min；进入循环 95 变性 15s， 60 运行 35s ， 共 35个循环。 G.3.
31、5 检测结果 循环阈值（ Cycle threshold value） Ct值：是在 PCR扩增过程中 ， 荧光信号开始由本底进入指数增长 阶段的拐点所对应的循环次数 ， 是实时荧光定量 PCR检测结果判读的依据。 当检测样品 30Ct 12时 ， 含有松材线虫； Ct 35或者无 Ct值 ， 不含松材线虫； 35Ct 30， 可能出 现假阳性 ， 应重新检测。 DB21/T 3378 2021 16 H H 附 录 H （规范性） 松材线虫分子生物学检验送检表 表 H.1 松材线虫分子生物学检验送检表 送检单位 ： 送检日期： 样号 采样 地点 样品数量 树种 备注 注： “采样地点” 填写到小班。例如：县镇（林场）林班小班。 I DB21/T 3378 2021 17 附 录 I （规范性） 松材线虫检验鉴定报告 DB21/T 3378 2021 18 _
