1、ICS 65.020.30 B 41 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 987 2020 鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素 类兽药残留量的测定 液相色谱 -串联质谱 法 Determination of residues of sulfonamides, quinolones and tetracyclines in fresh and frozen meat of livestock and poultry by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020 - 10 - 14发布 2020 - 11 - 15实施
2、 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 987 2020 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位： 天津市 农业质量标准与检测技术研究所、摩天众创（天津）检测服务有限公司 。 本标准主要起草人： 李娜、林宏芳、邵辉、李辉、刘磊、张玉婷、郭永泽、绳慧珊、卢娜、冯 兆欣、 郝玉杰、潘喆 。 DB12/T 987 2020 1 鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类兽药残留量的测定 液 相色谱 -串联质谱法 1 范围 本标准规定了鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类兽药残留量的测定 -液相色谱 -串联
3、质谱 法的方法提要、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定步骤、灵敏度、准确度和精密度。 本标准适用于鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类共 28种兽药残留的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经酸化乙腈提取，提取液浓缩、甲醇定容后，用液相色谱 -串联质谱仪（ LC-MS/MS）测定，基 质外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 基本要求 除另有说明外，所用试剂均为
4、分析纯。所用水为 GB/T 6682规定的一级水。 4.2 试剂 4.2.1 乙腈：色谱 纯 。 4.2.2 甲醇：色谱 纯 。 4.2.3 甲酸：色谱 纯 。 4.2.4 乙酸：色谱 纯 。 4.2.5 正己烷。 4.2.6 无水硫酸钠。 4.2.7 乙二胺四乙酸二钠（ Na2EDTA2H2O）。 4.2.8 柠檬酸（ C6H8O7H2O）。 4.2.9 磷酸氢二钠（ Na2HPO412H2O） 4.2.10 氢氧化钠（ NaOH）。 4.3 溶液配制 DB12/T 987 2020 2 4.3.1 氢氧化钠溶液 （ 1 mol/L） ：称取 4.0 g 氢氧化钠，用水溶解 并 定容至 10
5、0 mL。 4.3.2 氢氧化钠溶液 （ 0.03 mol/L） ：称取 0.12 g 氢氧化钠，用水溶解 并 定容至 100 mL。 4.3.3 Na2EDTA-McIlvaine 缓冲溶液（ 0.1 mol/L）：称取 12.9 g 柠檬酸， 10.9 g 磷酸氢二钠， 37.2 g 乙二胺四乙酸二钠，加 900 mL 水溶解，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调 pH 值至 4.0，加水 定容 至 1000 mL。 4.3.4 0.1%甲酸水：移取 0.1 mL 甲酸加入 100 mL 水中，混匀。 4.3.5 0.1%甲酸甲醇：移取 0.1 mL 甲酸加入 100 mL 甲醇中，混匀。
6、4.3.6 甲醇 -0.1%甲酸（ 10:90， V:V）：移取 10 mL 甲醇加入 90 mL 0.1%甲酸水溶液中，混匀。 4.4 标准品 磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺 胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁 啉、麻保沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、土霉素、金霉素、强力 霉素标准品：纯度 98.0%； 环丙沙星 纯度 95.0%， (达氟 )单诺沙星 纯度 94.0%， 沙拉沙星 纯度 95.0%， 四环素 纯度 96.5%。 4.5 标准溶液 配制
7、 4.5.1 标准储备溶液 （ 1000 mg/L） ： 准确称取 10 mg 各兽药标准品， 根据标准品的溶解性不同， 磺胺 类 、四环素类兽药 用乙腈溶解 并定容至 10 mL，喹诺酮类兽药 先 用 2 mL 氢氧化钠溶液溶解，甲醇定容 至 10 mL，于 -18 避光 保存，有效期 1 年 。 4.5.2 标准工作溶液 ： 分别吸取 28 种兽药标准储备液 0.25 mL 于 25 mL 容量瓶，用乙腈稀释并定容， 配制成浓度为 10 mg/L 的混合标准工作液，于 4 避光 保存，有 效期 1 个月。 4.6 材料 4.6.1 十八烷基硅烷 键合硅胶 （ C18）： 4060 m。 4
8、.6.2 氨基 硅烷化硅胶 （ NH2）： 4060 m。 4.6.3 微孔滤膜（有机相）： 0.22 m。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 -串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ ESI）。 5.2 分析天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 5.3 台式高速离心机：转速不低于 4000 r/min。 5.4 匀浆机。 5.5 涡旋混合器。 5.6 氮吹仪。 5.7 纯水仪 。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 鲜、冻畜禽肉类样品剔去毛、淤血、骨等，取缩分后样品，用 匀浆机捣碎 成肉糜状 ， 混匀， 装入清 洁容器内，密封并 标识 。 用冷冻畜禽肉类样 品在室温下自然解冻至稍微变软
9、，且冻水未流出待制备。 DB12/T 987 2020 3 6.2 试样保存 试样应在 -18 条件下保存。 7 测定步骤 7.1 样品前处理 准确称取试样 2.00 g（精确至 0.02 g）于 50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入 2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液， 3 mL乙腈，涡旋 2 min， 4000 r/min离心 5 min，收集上清液于另一 50 mL 离心管中，残渣加 5 mL乙腈，涡旋 2 min， 4000 r/min离心 5 min，合并上清液于上述 50 mL离心管中。 于上清液中依次加入 200 L乙酸， 1 g氯化钠，涡旋
10、1 min， 4000 r/min离心 5 min，取上层乙腈相 2 mL 于 10 mL聚丙烯塑料离心管中，加入 C18和 NH2吸附剂各 100 mg，涡旋 1 min， 4000 r/min离心 5 min，取上 清液，氮气吹干。残渣用 1 mL 甲醇 -0.1%甲酸水（ 10:90， V:V）定容，过 0.22 m有机滤膜。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱条件 如下： 色谱柱： Acquity BEH RP18柱 (2.1100 mm， 1.7 m)； 流动相： A 相： 0.1%甲酸甲醇； B 相： 0.1%甲酸水；梯度洗脱条件见表 1。 进样量： 10 L； 柱温： 30 。
11、表 1 梯度洗脱条件 时间 (min) 流速 (mL/min) VA(%) VB(%) 曲线 a 0 0.2 5 95 Initial 3 0.2 20 80 6 7 0.2 40 60 6 10 0.2 40 60 6 11 0.2 90 10 6 12 0.2 90 10 6 14 0.2 5 95 1 a 表示线性变化， 1 表示立即变化。 7.2.2 质谱条件 如下： 电离 源 ：电喷雾 正离子 (ESI+)； 毛细管电压： 3.0 kV； 离子源温度： 120 ； 脱溶剂气温度： 400 ； 脱溶剂气流量： 600 L/h； 锥孔反吹气流量： 60 L/h； 检测方式：多反应监测（
12、MRM）； 质谱采集参数 附录 A。 7.3 定性 DB12/T 987 2020 4 液相色谱 -串联质谱法 对样品 定性 确证 须满足以下 要求： 待测样品的保留时间在外标标准样品的保留时间的 2.5%之内； 定性离子的信噪比大于 3（ S/N3）； 与外标标准品相比，样品的两个特征离子相对丰度在表 2 规定的许可范围内。 28种兽药的 多反应监测（ MRM） 色谱图 参 见附录 B。 表 2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度比（ %） 允许的最大偏差（ %） 50 2 0 20 50 25 10 20 30 10 50 7.4 定量 采用 外标法定量 。用色谱数据处理软
13、件或按 公 式（ 1）计算试样中的 目标物 含量（ g/kg）： mVVVAAss 12 3 . (1) 式中： 试样中 目标物的 含量， 单位为微克每千克（ g/kg）； s 目标物 标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（ g/L）； A 试样测定液中 目标物定量离子 的峰面积； As 标准工作溶液中 目标物定量离子 的峰面积； V1 提 取溶液中乙腈的总体积（ mL）； V2 吸取用来净化的提取溶液的体积（ mL） V3 最终定容体积（ mL）； V 试样 溶液定容体积，单位为毫升（ mL）； m 试样 溶液所代表试样的量，单位为克（ g）； 注： 计算结果保留两位有效数字，当结果大于 1
14、g/kg时保留三位有效数字。 8 灵敏度 28种兽药的 检测限 在 0.5 g/kg 3.0 g/kg之间。磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、 磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲 氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺间二甲 氧嘧啶、磺胺喹噁啉、麻保沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、单诺沙星、 环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、噁喹酸、氟甲喹 的定量限为 5.0 g/kg， 四环素、土霉素、 金霉素和强力霉素的定量限均为 10.0 g/kg。 9 准确度和精密度 9.1 准确度 DB12/T 987 2020 5 9.1.1 鲜、冻畜禽肉 中磺胺类
15、和喹诺酮类兽药在 5 g/kg 50 g/kg 添加 水平 ， 回收率在 70% 110% 之间 ； 9.1.2 鲜、冻畜禽肉 中 四环素 类兽药在 10 g/kg 50 g/kg 添加 水平 ， 回收率在 70% 110%之间 。 9.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过 算术平均值的 15%。 DB12/T 987 2020 6 A A 附 录 A （资料性附录） 28种兽药 检测 表 A.1 28种兽药中英文名称、保留时间、质谱检测条件和定量限 名称 保留时间 (min) 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 锥孔电压 (V) 碰撞能量 (V) 检
16、测限 (g/kg ) 定量限 (g/kg) 磺胺醋酰 Sulfacetamide 4.15 215/155.8;215/10 7.7 215/155.8 18 12;23 1.2 5.0 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 4.52 251/155.8;251/10 7.7 251/155.8 25 18;28 1.3 5.0 磺胺吡啶 Sulfapyridine 4.87 250.2/155.8;250. 2/184 250.2/155. 8 25 15;16 1.0 5.0 磺胺噻唑 sulfathiazole 4.99 256.2/107.8;256. 2/155.8 256.2/107
17、. 8 20 14;21 1.5 5.0 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine 5.38 265/155.8;265/17 1.8 265/171.8 25 20;16 0.5 5.0 麻保沙星 Marbofloxacin 5.38 363.1/320.1;363. 1/345 363.1/320. 1 30 20;23 1.2 5.0 四环素 Tetracycline 5.94 445/428;445/410 445/410 25 19;25 2.8 10 氧氟沙星 Ofloxacin 6.03 362/318.2;362/26 1.1 362/261.1 30 24;31 0.5 5.
18、0 磺胺二甲基嘧啶 Sulfamethazine 6.17 279/186;279/124 279/186 30 16;20 0.5 5.0 土霉素 Oxytetracycline 6.15 461/443;461/426 461/426 25 15;25 3.0 10 诺氟沙星 Norfloxacin 6.63 320.1/276.1;320. 1/302.1 320.1/302. 1 30 20;24 1.0 5.0 单诺（达氟）沙星 Danofloxacin 6.82 358.1/340.1;358. 1/81.6 358.1/340. 1 25 28;45 1.5 5.0 环丙沙星 C
19、iprofloxacin 6.77 332.1/314.1;332. 1/288.1 332.1/314. 1 30 25;20 1.0 5.0 恩诺沙星 Enrofloxacin 6.82 360.2/316;360.2/ 245 360.2/316 30 25;33 1.0 5.0 磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyrid azine 6.80 281/155.8;281/107.7 281/155.8 30 20;30 0.8 5.0 DB12/T 987 2020 7 磺胺甲噻二唑 Sulfamethizole 6.80 271.2/107.8;271. 2/155.8 271
20、.2/155. 8 22 22;13 0.8 5.0 二氟沙星 Difloxacin 7.37 400/382;400/356 400/382 35 25;24 0.5 5.0 沙拉沙星 Sarafloxacin 7.87 386/368;386/299 386/368 35 24;35 0.5 5.0 磺胺氯哒嗪 Sulfachloropyrida zine 8.13 285/155.8;285/107.7 285/155.8 24 20;30 1.2 5.0 磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole 8.24 254/155.8;254/10 7.7 254/155.8 25 20;2
21、5 0.8 5.0 金霉素 Chlortetracycline 8.77 479/462;479/444 479/444 35 20;25 3.0 10 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxin e 8.70 281/155.8;281/107.7 281/155.8 30 18;25 1.3 5.0 磺胺异恶唑 sulfisoxazole 9.16 268.3/107.8;268. 3/155.8 268.3/155. 8 22 26;13 0.8 5.0 强力霉素 Doxycycline 11.48 445/428;445/154 445/428 25 20;35 2.5 10
22、噁喹酸 Oxolinic acid 11.60 262/244;262/159. 8 262/244 27 22;43 1.2 5.0 磺胺间二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine 11.78 311/155.8;311/10 7.7 311/155.8 32 25;35 1.0 5.0 磺胺喹噁 啉 Sulfaquinoxaline 11.92 301/155.7;301/10 7.7 301/155.7 28 15;25 1.0 5.0 氟甲喹 Flumequine 12.01 262/244;262/202 262/244 25 20;37 0.5 5.0 DB12/T 987 2
23、020 8 B B 附 录 B （资料性附录） 28种兽药的多反应监测（ MRM）色谱图 2.0 4.0 6.00 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.00 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 95 215 155.8 (SA) 2.39e 4.1 215 107.7 (SA) 1.49e 4.1 251 155.8 (SD) 1.50e 4.5 251 107.7 (SD) 1.89e 4.5 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
24、 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 250.2 184 (SPD) 4.76e4.8 250.2 155.8 (SPD) 5.50e 4.8 256.2 155.8 (STZ) 7.39e 4.9 256.2 107.8 (STZ) 2.31e 4.9 DB12/T 987 2020 9 Tim 2.00 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % -5 9 2.00 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
25、% -5 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 265 171.8 (SM1) 1.63e5.3 265 155.8 (SM1) 1.09e 5.3 363.1 345 (MAR) 6.27e 5.3 363.1 320.1 (MAR) 8.14e 5.3 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.
26、0 % - 9 445 427 (TC) 5.40e5.9 445 410 (TC) 1.01e 5.95.0 11.4 362 318.2 (OFL) 4.21e 6.0 362 261.1 (OFL) 4.34e 6.0 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 279 186 (SM2) 1.65e6.1 279 124 (SM2) 4.47e 6.1 461 443
27、(OTC) 7.38e 6.1 461 426 (OTC) 1.12e 6.1 5.5 DB12/T 987 2020 10 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 320.1 302.1 (NOR) 3.43e6.6 320.1 276.1 (NOR) 1.98e 6.6 358.1 340.1 (DAN) 2.63e 6.8 358.1 81.6 (DAN) 2.48e
28、 6.8 7.1 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 332.1 314.1 (CIP) 2.29e6.7 332.1 288.1 (CIP) 1.03e 6.7 360.2 316 (ENR) 3.11e 6.8 360.2 245 (ENR) 1.64e 6.8 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0
29、10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 271.2 155.8 (SMTZ) 2.42e6.8 271.2 107.8 (SMTZ) 5.43e 6.8 281 155.8 (SMP) 2.82e 6.8 281 107.7 (SMP) 3.44e 6.8 DB12/T 987 2020 11 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.
30、0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 400 382 (DIF) 3.79e7.3 400 356 (DIF) 3.26e 7.3 386 368 (SAR) 2.54e 7.8 386 299 (SAR) 1.12e 7.8 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 285 155.8 (SCP) 2.09e8.1 285 107.
31、7 (SCP) 2.76e 8.1 254 155.8 (SMZ) 1.43e 8.2 254 107.7 (SMZ) 2.61e 8.2 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 479 462 (CTC) 3.02e8.7 479 444 (CTC) 3.46e 8.7 281 155.9 (SMM) 6.48e 8.7 281 107.8 (SMM) 1.67e 8.7
32、 DB12/T 987 2020 12 Tim 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % -1 8 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 % - 9 268.3 155.8 (SIZ) 2.69e9.1 268.3 107.8 (SIZ) 7.41e 9.1 445 428 (DC) 4.08e 11.4 445 154 (DC) 2.74e 11.4 Tim 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9
33、 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9 262 244.1 (OA) 9.82e12.0 262 216 (OA) 6.38e 11.6 311 155.8 (SDM) 9.65e 11.7 311 107.7 (SDM) 1.30e 11.7 Tim 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.
34、0 14.0 % - 9 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 % - 9 301 155.7 (SQ) 2.39e11.9 301 107.7 (SQ) 9.26e 11.9 262 244 (FLU) 7.06e 12.0 262 202 (FLU) 2.73e 12.0 DB12/T 987 2020 13 注 1： 4.15min-磺胺醋酰 (SA) 4.52min-磺胺嘧啶 (SD) 注 2： 4.87min-磺胺吡啶 (SPD) 4.99min-磺胺噻唑 (STZ) 注
35、 3： 5.38min-磺胺甲基嘧啶 (SM1) 5.38min-麻保沙星 (MAR) 注 4： 5.94min-四环素 (TC) 6.03min-氧氟沙星 (OFL) 注 5： 6.15min-土霉素 (OTC) 6.17min-磺胺二甲基嘧啶 (SM2) 注 6： 6.63min-诺氟沙星 (NOR) 6.82min-单诺（达氟）沙星 (DAN) 注 7： 6.77min-环丙沙星 (CIP) 6.82min-恩诺沙星 (ENR) 注 8： 6.80min-磺胺甲噻二唑 (SMTZ) 6.80min-磺胺甲氧哒嗪 (SMP) 注 9： 7.37min-二氟沙星 (DIF) 7.87min-沙拉沙星 (SAR) 注 10： 8.13min-磺胺氯哒嗪 (SCP) 8.24min-磺胺甲噁唑 (SMZ) 注 11： 8.77min-金霉素 (CTC) 8.70min-磺胺间甲氧嘧啶 (SMM) 注 12： 9.16min-磺胺异噁唑 (SIZ) 11.48min-强力霉素 (DC) 注 13： 11.60min-噁喹酸 (OA) 11.78min-磺胺间二甲氧嘧啶 (SDM) 注 14： 11.92min-磺胺喹噁啉 (SQ) 12.01min-氟甲喹 图 B.1 28种兽药的多反应监测（ MRM）色谱图 _
