1、 ICS 13.310 A 92 中华人民共和国公共安全行业标准 GA 法庭科学 毛发 、血液 中 四氢大麻酚和四氢 大麻酸 检验 气相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for tetrahydrocannabinol and tetrahydrocannabinol-9-carboxylicacid acid in hair and blood samples GC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容
2、可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会( SAC/TC 179/SC 1) 提出并 归口。 本标准 起草单位: 公安部物证鉴定中心、中国药品生物制品检定所 。 本标准 主要 起草人 : 张云峰、常靖、 崔巍、刘耀、南楠、朱军、于忠山、陈华、左宁 。 GA/T 1 法庭科学 毛发、血液中 四氢大麻酚和四氢大麻酸 检验 气相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 毛发 、 血 液 中四氢大麻酚 ( 9-THC) 和 四氢大麻酸 ( 9-THC-COOH) 的 气 相色谱 -质谱( GC-MS) 定性定量 检验
3、方法 。 本标准适用于 法庭科学 毛发 、 血液 中四氢大麻酚 和 四氢大麻酸的 定性分析和定量分析。其他可疑 样 品 中 四氢大麻酚 和 四氢大麻酸 的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分 析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照,按平行操作的要求,对毛发、血液进行提取、净
4、化 、 浓缩 及衍生化 , 采用气相色谱 -质谱法定性定量,以 目标物 各组分 衍生化产物的 保留 时间、 质谱特征离子碎片峰和相对 丰度比作为定性判断依据;以峰面积为依据,采用外标法 或内标法 进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682中规定的三级水 。 除非另有说明,在分析中使用的试剂均为分析纯, 试 剂包括: a) 甲醇 ; b) 乙酸乙酯 ; c) 正己烷 ; d) 乙酸 ; e) 生理盐水 ; f) 乙腈 ; g) 0.1%十二烷基硫酸钠水溶液; h) 1mol/L 氢氧化钠溶液 : 称取 4.0g 氢氧化钠,用 水 溶解并 稀释 至 100
5、mL; GA/T 2 i) 正己烷 /乙酸乙酯 (体积 比 9:1)混合溶剂 ; j) 衍生化试剂: 五氟丙醇( PFPOH) 或五氟丙酸酐( PFPA)或其他合适的酰化衍生化试剂 ; k) 标准 溶液: 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 : 采用市售标准溶液 ; 2) 10.0g/mL 标准物质工作溶液 : 移取 1.0mg/mL 的 四氢大麻酚和四氢大麻酸 标准物质溶液 各 0.1mL,用甲醇稀释至 10mL,混匀,配制成浓度为 10.0g/mL 的单一标准工作溶液, 密封,置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 1 月。实验中所用其他浓度单一标准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用
6、甲醇稀释得到; 3) 1.0mg/mL 内标溶液:根据 甲芬那酸 内标 物 ( 或其他 等效 内标物 ) 的纯度, 称取适量, 用 甲醇配制 1.0mg/mL 甲芬那酸 内标 溶液,置于冰箱中冷藏保存。有效期 2 个月。 或采用市 售标准溶液 ; 4) 10.0g/mL 内标 工作溶液: 移取 1.0mg/mL 的 甲芬那酸 内标 物质溶 液 0.1mL,用甲 醇稀释 至 10mL,混匀,配制成浓度为 10.0g/mL 的 内标 工作溶液,密封,置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 1 月。实验中所用其他浓度 内标 工作溶液均 由 10.0g/mL 内标溶液用甲醇稀释得到 。 注 : 特殊情况下可使
7、用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括: a) 具塞玻璃试管 ; b) 具盖离心管 ; c) 一次性注射器 。 6 仪器和设备 仪器和设备包括: a) 气相色谱 -质谱仪:配有电子轰击离子源( EI)及负化学离子源 ( NCI) ; b) 电子天平; c) 振荡器; d) 离心机; e) 超声波清洗器; f) 移液器; g) 浓缩器; h) 烘箱 。 7 操作 方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 毛发 样品 7.1.1.1.1 毛 发 清洗 GA/T 3 称 取 毛发 检材样品约 200mg, 将毛发 剪成长约 2cm 碎段,置于小烧杯中,依次用 甲醇
8、10mL、水 10mL、 甲醇 10mL 各振荡清洗 2min, 清洗 3 次以上, 自然晾干,于干净 铝箔纸 中 密封后保存。同时, 收集最后 一次 清洗毛发的甲醇溶液, 置于 浓缩器上 45 浓缩至干, 残留物按 7.1.1.1.3 进行衍生,供 GC 或 GC-MS 分析,结果呈阴性证明毛发外部无污染,否则重新清洗毛发,直至最后清洗溶液呈阴性。 7.1.1.1.2 液液 提取 将 晾干后 的毛发 检材样品 铰碎至 1mm 2mm 左右 (或用研磨仪研碎) , 称取 50mg 置于玻璃试管中 ( 若采用内标法 , 则再加入内标 1.0g/mL 甲芬那酸 30L, 混匀 ) , 加入 1mo
9、l/L 氢氧化钠 溶液 1mL, , 置于烘箱中 95 加热 , 至毛发样品全部溶解。冷却 , 将样品转移至具盖离心管中 , 加入 乙酸 1.0mL, 混匀 , 调 pH 值 至 3.5, 8000r/min 离心 10min, 取上清液, 加 入正己烷 /乙酸乙酯 (体积比 9: 1)混合溶剂 5mL, 超声 5min, 8000r/min 离心 10min, 提取有机相;重复提取一次,合并两次提取的有机相 。 置 于 浓缩器上 35浓缩至干,残留物按 7.1.1.1.3 进行衍生。 7.1.1.1.3 衍生化 取 7.1.1.1.3 中待衍生残留物, 加入 PFPA 100L 或 PFPO
10、H 75L,置于烘箱中 70 衍生化 30min。 冷却 , 在浓缩器上 35 浓缩至干 , 用 乙酸乙酯 50L 溶解 , 作为检材样品衍生液供 GC-MS 分析。 7.1.1.1.4 毛发 质控样品制备 称 取 清洗 晾干 后的 等量 空白毛发 样品 两 份 , 一份 作为 空白样品 ,一 份添加 四氢大麻酚和四氢大麻酸 标准物质 各 100ng 作为添加样品 , 与 检材平行操作,得到空白样品衍生液和添加样品衍生液供仪器 分析 。 若采用内标法 , 可不做添加样品 , 空白样品 (不加内标)与检材平行操作,同时做内标物质 和 标准 物质的衍生化,供仪器分析。 7.1.1.2 血液 样品
11、7.1.1.2.1 血液 提取 移 取 血液 检材 样品 1.0mL 于 具盖离心管中 ,( 若采用内标法 , 则 加入内标 1.0g/mL 甲芬那酸( MFA) 50L, 混匀 ) ,加乙腈 1mL, 振荡 15min, 8000r/min 离心 10min,取上清液, 加 10%乙酸 0.4mL、 生理 盐水 2mL,混匀后调 pH 值 至 3.5, 8000r/min 离心 10min,取上清液,加入有机相正己烷 /乙酸乙酯 混合 溶剂 ( 体积比为 9:1) 5mL, 振荡 5min, 8000r/min 离心 10min,取有机相 4.5mL 并转移至玻璃试管中, 在浓缩器上 35
12、下浓缩至 约 1mL,定量转移至 玻璃试管中, 35 下快速浓缩至干 。残 留物需 按 7.1.1.2.2 进行 衍生 。 7.1.1.2.2 衍生化 在 7.1.1.2.1 的残留物中, 加入 PFPA 20L 和 PFPOH 5L,置于烘箱中 70 衍生化 30min, 冷却 , 在浓缩器上 35 浓缩至干 , 用 乙酸乙酯 50L 溶解, 作为检材样品衍生液供 GC-MS 分析 。 7.1.1.2.3 血液 质控样品制备 取 等量 空白血液 两 份 于 具盖离心管中 , 一份作为空白样品, 一份添加 四氢大麻酚和四氢大麻酸 标准 物质 作为添加样品 (添加样品的浓度为 50ng/mL)
13、, 与 检材平行 操作,得到空白样 品 衍生液 和添加样品 衍生液 供仪器 分析 。 若采用内标法 , 可不做添加样品 , 空白样品 (不加内标)与检材平行操作,同时做内标物质 和 标准 物质的衍生化,供仪器分析。 GA/T 4 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 气相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件,可根据不同品牌仪器和不同样品 等 实际情况进行调整: a) 离子源:电子轰击离子源( EI) 或 负化学离子源( NCI) ; b) 色谱柱: DB-5MS 毛细色谱柱 ( 30m0.25mm0.25m) 或等效色谱柱 ; 注 : DB-5MS 为 Agilent 公司产品的商品名称,给出这
14、一信息是为了方便本标准的使用者, 并不是表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。 c) 色谱柱温程: 80保持 2min,以 30/min 速率升温至 280,保持 16.5min; d) 进样口温度: 280; e) 传输线温度: 250; f) 离子源 温度 : 230; g) 载气:高纯 氦 ; h) 柱流量: 1mL/min; i) 进样方式 : 分流进样 , 分流比 为 5: 1; j) 扫描方式:全扫描( SCAN) , 质谱扫描范围 40amu 700amu; 或选择离子监测 (SIM); k) 四氢大麻酚和 四氢大麻酸 五氟丙酸酐衍生物的 质
15、谱特征离子碎片峰 : 见表 1 及表 2。 表 1 电子轰击离 子源( EI)检测特征峰值表 目标物 特征峰 1 特征峰 2 特征峰 3 四氢大麻酚五氟丙酸酐衍生物 m/z 73 m/z 377* m/z 460 四氢大麻酸五氟丙酸酐衍生物 m/z 129 m/z 459* m/z 622 甲芬那酸五氟丙酸酐衍生物 m/z 194 m/z 398* m/z 519 注: *为定量离子 。 表 2 负化学离子源( NCI)检测特征峰值表 (未标定量离子) 目标物 特征峰 特 征峰 四氢大麻酸五氟丙酸酐衍生物 m/z 602 m/z 622 甲芬那酸五氟丙酸酐衍生物 m/z 479 m/z 519
16、 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品衍生液及标准工作溶液衍生液,按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 7.2.1.1 毛发 样品 毛发检材样品按 7.1.1.1.1 进行清洗晾干后 , 称 取 50mg 两份 ( 若采用内标法 , 则加入内标甲芬那酸 GA/T 5 30ng, 混匀 ) ,按 7.1.1.1.27.1.1.1.4 操作 。 同时 称 取 清洗 晾干 后的 等量 空白毛发 样品 三 份, 其中两份分别添加 四氢大麻酚和四氢大麻酸标准物 质作为添加样品 ( 添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的 ( 100 30
17、) %,若采用内标法, 则添加样品中还需加入内标甲芬那酸 30ng), 另一份作为空白样品 , 与检材 样品 平行操作,得到空白样 品衍生液和添加样品衍生液供仪器 分析 。 7.2.1.2 血液样品 制备 移取 血液 检材 样品 1.0mL 两份 ( 若采用内标法 , 则加入内标甲芬那酸 100ng, 混匀 ),按 7.1.1.2 操 作 。 同时 移 取等量空白血液 三 份, 其中两份分别添加四氢大麻酚和四氢大麻酸标准物质作为添加样品 (添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的( 100 30) %,若采用内 标法,则添加样品中 还需加入内标甲芬那酸 100ng),另一份作为空白样品,
18、与检材样品平行操作,得到空白样品衍生液和 添加样品衍生液供仪器分析。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品 衍生液 及标准工作溶液衍生液,按 7.1.2.1 分析条件每个样品进样 分析 2 3 次。若要报告测量不确定度,每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标 -单点法 记录各样品 衍生液 平 行进样 2 3 次的目标物保留时间和峰面积值,按公式( 1)计算含量: 样样添 添添样 VMA VMAW = . (1) 式中: W 检材样
19、品 中目标物的含量,单位为 纳克 每毫克 ( ng/mg) 或 纳克 每毫升( ng/mL) ; A 样 检材 样品 衍生液 中目标物峰面积平均值; M 添 添加样品中标准物添加量,单位为 纳克 ( ng) ; V 样 检材 样品 的定容体积,单位为毫升 ( mL) ; A 添 添加样品 衍生 液 中目标物峰面积平均值; M 样 检材 样品 的取样量,单位为毫克 ( mg) 或毫升 ( mL) ; V 添 添加样品的定容体积,单位为毫升 ( mL) 。 7.2.3.1.2 内标 -单点 法 记录各样品衍生液平行进样 2 3 次的目标物保留时间和峰面积值,按公式( 2)计算校正因子,按 GA/T
20、 6 公式( 3)计算含量: MAf = 标内 内标 . (2) 式中: f 校正因子; M 标 添加样品中 目标物添加量 ,单位为 纳克 (ng); A 内 添加样品中 内标物添加峰面积 平均值 ; M 内 添加样品中 内标物添加量 ,单位为 纳克 (ng); A 标 添加样品中 目标物添加峰面积 平均值 。 样样添 添添样 VMA VMAfW = . (3) 式中: W 检材 样品中 目 标物 的 含量 ,单位为 纳克每毫克( ng/mg)或纳克每毫升 ( ng/mL) ; f 校正因子; A 样 检材 样品 衍生液 中目标物平均峰面积; A 添 添加样品 衍生液 中目标物平均峰面积; M
21、 添 添加样品中 目标物 添加量 ,单位为 纳克 (ng); M 样 检材样品的取样量 , 单位为纳克每毫克( ng/mg)或纳克每毫升( ng/mL); V 添 添加样品的定容体积 ,单位为 毫升 (mL); V 样 检材 样品的定容体积 ,单位为 毫升 (mL)。 7.2.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作的 检材 样品中目标物的 含量,按公式( 4)计算相对相差: %10021 = X XXRD . (4) 式中: RD 相对相差 ,用百分比( %)表示 ; X1、 X2 两个检材 样品 平行定量测定的含量数值; X 两个检材 样品 平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价
22、8.1 定性结果评价 8.1.1 阳 性结果评价 在相同条件下进行样品测定时,检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致(相对误差在 1%之内),且在扣除背 景后的检材样品质谱图中,目标物的质谱特征离子与标准溶液一致,特征离子 丰度比与浓度接近的标准溶液相比,相对偏 差不超过表 3 规定的范围,空白样品无干扰,则可判断检材 GA/T 7 样品中检出目标物。 表 3 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 8.1.2 阴 性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰,且添加样品中出现
23、与目标物标准溶液一致的色谱 峰,空白样品无干扰,则可判断检材样品中未检出目标物。 8.2 定量结果评价 如果目标物 含量的 RD 20%,定量数据可靠,其含量按 两 份检材的平均值计算。 如果 检材样品中 目标物含量的 RD 20%,定量数据不可靠 , 应按 7.2重新提取检验。 本方法 的相关实验数据及谱图参加附录 A和附录 B。 GA/T 8 附 录 A (资料性附录) 相关实验数据 A.1 毛发样品 相关线 性 范围 : a) 采用 EI 作为离子源检测四氢大麻酚的五氟丙酸酐衍生物的线性范围在 1ng/mg 100ng/mg; b) 采用 EI 作为离子源检测四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物
24、的线性范围在 1ng/mg 100ng/mg; c) 采用 NCI 作为离子源检测四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的线性范围在 0.5ng/mg 50ng/mg。 不同提取方法和仪器检测线性范围可能有 所差异,均属正常。 A.2 血液样品 相关线性 范围 及检出限 : a) 采用 EI 作为离子源检测四氢大麻酚的五氟丙酸酐衍生物的线性范围在 1ng/mL 1000ng/mL; b) 采用 EI 作为离子源检测四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的线性范围在 1ng/mL 1000ng/mL; c) 采用 NCI 作为离子源检测四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的线性范围在 0.5ng/mL 500ng/mL;
25、d) 本方法四氢大麻酚五氟丙酸酐衍生物的检 出 限 为 1ng/mg 或 1ng/mL( EI);四氢大麻酸五氟丙酸 酐衍生物的检 出 限为 1ng/mg 或 1ng/mL( EI)、 1ng/mg 或 1ng/mL( NCI)。 不同提取方法和仪器检测线性范围可能有所差异,均属正常。 GA/T 9 附 录 B (资料性附录) 相关 谱图 B.1 四氢大麻酚的五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-EI 分析谱 图 见图 B.1。 图 B.1 四氢大麻酚的五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-EI 分析谱 图 B.2 四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-EI 分析谱 图 见图 B.2。 图 B.2
26、四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-EI 分析谱 图 B.3 甲芬那酸五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-EI 分析谱 图 见图 B.3。 GA/T 10 图 B.3 甲芬那酸五氟丙 酸酐衍生物的 GC-MS-EI 分析谱 图 B.4 四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-NCI分析谱 图 见图 B.4。 图 B.4 四氢大麻酸的五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-NCI 分析谱 图 GA/T 11 B.5 甲芬那酸五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-NCI 分析谱 图 见图 B.5。 图 B.5 甲芬那酸五氟丙酸酐衍生物的 GC-MS-NCI 分析谱 图 B.6 9-THC、 9-THCA、 MFA 的衍生化物 EI 检测 总 离子 流 色谱图 见图 B.6。 说明 : 1-MFA 衍生化物; 2- 9-THC 衍生化物; 3- 9-THCA 衍生化物。 图 B.6 9-THC、 9-THCA、 MFA 的衍生化物 EI 检测 总 离子 流 色谱图 GA/T 12 B.7 9-THCA、 MFA 的衍生化物 NCI 提取离子色谱图 见图 B.7。 说明 : 1-MFA 的衍生化物; 2-9-THCA 的衍生化物。 图 B.7 9-THCA、 MFA 的衍生化物 NCI 提取离子色谱图