1、ICS 65.020.01 B61 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 17142018 宁夏枸杞组织培养育苗技术规范 2018 - 12 - 26 发布 2019 - 03 - 20 实施 青海省市场监督管理局 发布 DB63/T 17142018 I 前 言 本标准的编写符合GB/T 1.1-2009给出的规则。 本规范由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。 本规范起草单位:中国科学院西北高原生物研究所。 本标准起草人：王莉、李毅、胡延平、王溪、王建科、王均、石琳、杨文韬。 DB63/T 17142018 1 宁夏枸杞组织培养育苗技术规范 1 范围 本标准规定了宁夏枸杞（ Lyc
2、ium barbarum L.）组织培养快繁育苗中的术语和定义、一般要求，描 述了前期准备、外植体处理和培养方法，给出了宁夏枸杞组织培养育苗不同阶段的技术内容。 本标准适用于宁夏枸杞组织培养育苗。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件，本标准使用的其它术语
3、、定义见附录A规定。 3.1 不定苗 adventiti ous shoots 离体条件下由植物器官或组织形成的苗。 3.2 再生植株 Plantlet 不定苗生根后形成的完整植株。 3.3 预培养 pre-culture 在对外植体进行诱导培养前，先在无激素或无附加物的培养基上进行的第一个培养过程。 4 一般要求 4.1 本标准所使用的试剂纯度不低于附录 B 的规定。 4.2 在配制溶液和培养基母液时使用不低于 GB/T 6682 规定的二级水，配制培养基使用不低于三级水。 当溶液、母液和培养基等出现浑浊、沉淀或出现微生物污染时，须重新配制。 4.3 本标准中所用溶液以%表示的，除乙醇为体积
4、分数外，均为质量分数。 DB63/T 17142018 2 5 前期准备 5.1 培养基母液配制 依据改良MS培养基的组成，即附录C的规定。按照10倍量配制大量元素母液，按照100倍量配制微量 元素母液和有机元素母液，按照200倍量配制铁盐母液。将配制好的母液分别装入玻璃瓶中，铁盐母液 须使用棕色玻璃瓶，分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数及日期，贮存在2 4 的冰箱中。 5.2 植物生长调节剂配制 植物生长调节剂选用附录B，单独配成0.1 mg/ml的溶液。分别贴上标签，注明名称、配制浓度和日 期，贮存在2 4 的冰箱中。 5.3 其他试剂配制与使用 5.3.1 分别配制 0.1%的氯化汞、
5、70%乙醇、10 mg/ml 柠檬酸钠、1 0 mg/ml L-抗坏血酸和 10 mg/ml 肌 醇、1M 氢氧化钠和 1M 盐酸溶液，分别贴上标签，注明名称、配制浓度和日期，贮存在 2 4 的冰 箱中。 5.3.2 蔗糖和酸水解酪素按照培养基配方直接称量。 5.3.3 琼脂粉用量每批次需进行预备试验确定，在培养基中的最终浓度在 0.27%1.30%之间。 5.4 培养基配方 按照培养的目标和不同阶段，培养基分为预培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，其配 方如下： 预培养基：MS 基础培养基+6-BA0.2 mg/L0.3 mg/L +2,4-D2.0 mg/L+CH300 mg/L+
6、Vc2.0 mg/L+ 蔗糖 3%+琼脂粉； 诱导培养基：MS 基础培养基+6-BA3.0 mg/L+NAA0.0 m g/L2.0 mg/L+ CH300 mg/L+V c2.0 mg/L+ 蔗糖 3%+琼脂粉； 增殖培养基：MS 基础培养基+6-BA0.0 mg /L1.0 mg/L+ CH300 mg/L+Vc2.0 mg/L+蔗糖 3%+琼 脂粉； 生根培养基：MS 基础培养基+6-BA0.0 mg /L1.0 mg/L+ CH300 mg/L +蔗糖 3%+琼脂粉。 5.5 培养基的制备 培养基按照LY/T 1882之4.2.1的方法，并依据本标准附录C和5.4的配方要求配制，pH调
7、整为5.6 5.8。灭菌、保存按照LY/T 1882之4.2.2和4.2.3的方法。 6 外植体处理方法 6.1 外植体的获取 每年5月7月剪取无病、虫危害当年生嫩枝条。 6.2 外植体消毒 将去除叶片的嫩枝用流水冲洗干净后，剪成包 含2个3个叶腋的段，在超净工作台上用70%的酒精 漂洗茎段30s，再用0.1%的氯化汞消毒8 min 10 min，最后用无菌水冲洗4次6次。 DB63/T 17142018 3 7 培养方法与程序 7.1 外植体预培养 将无菌茎段接种于预培养基上，茎段下端应插入培养基。在温度为22 25 ，光照强度2000 Lux3000 Lux光照条件下培养2周。 7.2 腋
8、芽诱导培养 将深绿色、表面膨大、切口处有淡黄色愈伤组织出现的茎段外植体平放到诱导培养基上，茎段平放 入培养基上，在温度22 25 、光照强度2000 Lux30 00 Lux、光照时间12 h/d 14 h/d的条件 下培养2周3周，形成腋芽。 7.3 不定苗诱导分化培养 将新形成的腋芽切下， 转接至诱导培养基上， 在温度为22 25 ， 光照强度3000 Lux5000 Lux、 光照时间14 h/d16 h/d的条件下培养。培养3周4周后，腋芽在基部、叶腋处形成不定芽，逐渐生长 形成不定苗及不定苗丛。 7.4 不定苗增殖培养 将生长至1.0 cm2.0 cm的丛生不定苗从基部进行分割， 转
9、接于增殖培养基中。 在温度22 25， 光照强度为5000 Lux10000 Lux、光照时间为 14 h/d16h/d条件下培养4周。高度不足2.0 cm的不定 苗继代到增殖培养基培养，高度大于2.0 cm的不定苗进行生根培养。 7.5 生根培养 将高度大于2.0 cm丛生苗进行单株分离，视高度切段2.0 cm3.0 cm后接种到生根培养基中，在温 度22 25 ，光照强度3000 Lux5000 Lux、光照时间为16 h/天的条件下进行培养10 d14 d ， 基部生长出健壮根，形成再生植株后进行移栽。 DB63/T 17142018 4 A A 附 录 A （资料性附录） 植物组织培养
10、常用术语与定义 A.1 植物组织培养 Plant tissue culture 在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞及原生质体接种在适宜培养基上，在人工控制的条 件下培养形成器官或胚状体，进而形成完整植株的技术。 A.2 植物离体快速繁殖 Plant rap id propagation 应用植物组织培养和细胞培养技术，将优良植株的茎尖、腋芽、鳞片、叶片等器官、组织或细胞进 行离体培养，在短期快速获得大量遗传性稳定一致的个体。 A.3 外植体 Explant 在植物组织培养过程中，从植物体上分离下来，接种到培养技术培养的器官、组织、细胞及原生质 体。 A.4 愈伤组织 Callus 植物
11、在伤口处或植物组织培养中外植体切口处增殖形成的一团薄壁组织细胞团。 A.5 不定芽 adventi tious buds 离体条件下由植物器官或组织形成的芽。 A.6 植株再生 Plant r egeneration 不定苗生根后形成完整植株的过程。 A.7 培养基 Medium 根据植物生长发育所需营养元素和生理活性物质配置而成，供离体条件下植物器官、组织、细胞及 原生质体生长、分化的需要；一般包括无机盐类、碳源、有机成分、植物激素等。 A.8 灭菌 Sterilization 应用理化方法将培养基或外植体上所有微生物的营养细胞和芽孢杀灭或去除，从而达到无菌的过 程。 DB63/T 1714
12、2018 5 A.9 接种 inoculation 将灭菌出来后的外植体或培养材料在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。 A.10 诱导培养 shoots regeneration 灭菌处理后的外植体接种到诱导形成愈伤组织、胚状体、器官的培养基上培养的过程。 A.11 增殖培养 shoots multiplaction 经诱导培养所形成的组织、胚状体、器官转接到增殖培养基中培养使其不断增加数量。 A.12 生根培养 Rooting 把不定苗或芽转接到根诱导培养基中诱导生根，形成完整植株的过程。 A.13 诱导率 induc tion Rate 能够形成组织、器官或胚状体的外植体与全部外植体
13、的比率。 A.14 增殖系数 Propagati on coefficient 一个培养周期内不定芽或苗增殖的倍数，即培养一个周期后不定芽数/接种的不定芽数。 A.15 生根率 Rooting rate 一个培养周期内生根不定苗数占接种不定苗数的百分比。 DB63/T 17142018 6 B B 附 录 B （资料性附录） 植物组织培养常用试剂、药品表 表B.1给出了植物组织培养常用试剂、药品表。 表B.1 植物组织培养常用试剂、药品表 使用类别 名称 分子式或英文名 纯度与含量要求 单位 大量元素 硝酸铵 NH 4NO3 分析纯（AR） 500g 硝酸钾 KNO 3 分析纯（AR） 500
14、g 磷酸二氢钾 KH 2PO4 分析纯（AR） 500g 七水硫酸镁 MgSO 4.7H2O 分析纯（AR） 500g 二水合氯化钙 CaCl 2.2H2O 分析纯（AR） 500g 微量元素 硫酸铜 CuSO 4.5H2O 分析纯（AR） 500g 硫酸锌 ZnSO 4.7H2O 分析纯（AR） 500g 硫酸锰 MnSO 4.4H2O 分析纯（AR） 500g 碘化钾 KI 分析纯（AR） 500g 钼酸钠 Na 2MoO4.2H2O 分析纯（AR） 500g 氯化钴 CoCl 2.6H2O 分析纯（AR） 100g 硼酸 H 3BO3 分析纯（AR） 500g 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 N
15、a 2-EDTA 分析纯（AR） 250g 硫酸亚铁 FeSO 4.7H2O 分析纯（AR） 500g 有机物类 盐酸硫胺（VB 1） Thiamine. HCl BR 100g 盐酸吡哆醇（VB 6） Pyridoxine. HCl BR 25g 烟酸 Nicotine acid BR 100g L-抗坏血酸（Vc） Vitamin C BR 100g 肌醇 Myo-inositol BR 250g 甘氨酸 Glycine BR 100g 酸水解酪素 Casein acid hydrolysate BR 250g 消毒剂类 氯化汞 HgCl 2 分析纯（AR） 250g 吐温-20 Twee
16、n-20 CP 500ml 次氯酸钠 Antiformin CP 500ml 乙醇 Ethnol 分析纯（AR） 95% 500ml 高锰酸钾 KMnO 4 分析纯（AR） 100g 植物生长调节剂 吲哚乙酸 3-Indoleacetic acid 生物纯（BR） 5g 萘乙酸 1-Naphthylacetic acid 生物纯（BR） 100g 6-苄氨基嘌呤（6-BA） 6-Benzylaminopurine 生物纯（BR） 5g 6-糠氨基嘌呤（KT） 6-Furfurylaminopurine (Kinetin) 生物纯（BR） 1g DB63/T 17142018 7 表 B.1 植
17、物组织培养常用试剂、药品表 (续) 使用类别 名称 分子式或英文名 纯度与含量要求 单位 植物生长调节剂 2,4-二氯苯氧乙酸 （2，4-D） 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 生物纯（BR） 100g 反式玉米素 Zeatin 生物纯（BR） 99% 50mg 赤霉素 Gibberellic acid 生物纯（BR） 5g 吲哚丁酸 Indole-3-butyric acid 生物纯（BR） 1g 其它类 柠檬酸钠 sodium citrate 分析纯（AR） 500g 氢氧化钠 NaOH 分析纯（AR） 500g 盐酸 HCL 分析纯（AR） 500ml 蔗糖
18、Sucrose 分析纯（AR） 500g 琼脂粉 agar 生物纯（BR） 500g DB63/T 17142018 8 C C 附 录 C （资料性附录） MS 基础培养基配方表 表C.1给出了MS 基础培养基配方表。 表C.1 MS 基础培养基配方表 药品类别 药品名称 分子式或英文名 浓度 mg/L 大量元素 硝酸铵 NH 4NO3 1650 硝酸钾 KNO 3 1900 二水合氯化钙 CaCl 2.2H2O 440 七水合硫酸镁 MgSO 4.7H2O 370 磷酸二氢钾 KH 2PO4 170 铁盐 硫酸亚铁 FeSO 4.7H2O 27.8 乙二胺四乙酸二钠 Na 2-EDTA 37.3 微量元素 硫酸锰 MnSO 4.4H2O 22.300 硫酸锌 ZnSO 4.7H2O 8.600 碘化钾 KI 0.830 硼酸 H 3BO3 6.200 钼酸钠 Na 2MoO4.2H2O 0.250 硫酸铜 CuSO 4.5H2O 0.025 氯化钴 CoCl 2.6H2O 0.025 有机元素 甘氨酸 Glycine 2.0 肌醇 Myo-inositol 200.0 盐酸吡哆醇（VB 6） Pyridoxine.HCl 0.5 盐酸硫胺（VB 1） Thiamine. HCl 0.1 烟酸 Nicotine acid 0.5 _
