1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 789 2012猪 链 球 菌 2型 ELISA抗 体 检 测 方 法 Method of the enzyme-linked immunosobent assay for the detection of atibodiesagainst swine streptocosus suis serotype 2 2012 -01- 06发 布 2012 -03-01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 7892011 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12
2、 缩 略 词 .13 实 验 原 理 .1 4 实 验 条 件 .15 实 验 材 料 .16 样 品 处 理 .17 实 验 方 法 .28 结 果 判 定 .29 注 意 事 项 .2附 录 A.3 DB42/T 7892011 II 前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 、 武 汉 科 前 动
3、物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司 、 湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 康 超 、 张 安 定 、 钟 广 汉 、 周 艳 君 、 董 晓 辉 、 陈 焕 春 、 徐 高 原 、 孙 小 美 、李 淑 云 、 宋 念 华 。 DB42/T 7892011 III 引 言猪 链 球 菌 （ Streptococcus suis, SS） 是 一 种 能 引 起 猪 发 病 的 重 要 致 病 菌 ， 往 往 造 成 猪 群 感 染 和 大 量 死亡 ， 同 时 严 重 危 害 人 类 健 康 甚 至 导 致 死 亡
4、。 根 据 荚 膜 多 糖 分 型 ， 猪 链 球 菌 可 分 为 33 个 血 清 型 ， 其 中 猪链 球 菌 2 型 是 毒 力 最 强 、 流 行 最 广 的 血 清 型 。 为 了 有 效 地 预 防 和 控 制 猪 链 球 菌 2 型 病 ， 制 定 了 猪 链 球菌 2 型 ELISA 抗 体 的 检 测 方 法 ， 本 方 法 快 速 、 简 便 ， 易 操 作 ， 是 监 测 猪 2 型 链 球 菌 病 的 重 要 方 法 。 DB42/T 7892011 1 猪 链 球 菌 2 型 ELISA 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 猪 链 球 菌 2 型
5、ELISA 抗 体 的 检 测 方 法 的 缩 略 词 、 实 验 原 理 、 实 验 条 件 、 实 验 材 料 、样 品 处 理 、 实 验 方 法 、 结 果 判 定 和 注 意 事 项 等 。本 标 准 适 用 于 检 测 猪 血 清 中 的 猪 链 球 菌 2 型 抗 体 。2 缩 略 词下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay） ： 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 OD630nm值 ： 630纳 米 波 长 处 的 吸 光 值3 实 验 原 理酶 联 免 疫 吸 附 试 验 是 将 抗 原
6、 吸 附 在 固 相 载 体 上 ， 加 入 待 检 抗 体 ， 再 加 相 应 的 酶 标 记 抗 体 ， 生 成 抗 原-待 测 抗 体 -酶 标 记 抗 体 的 复 合 物 ， 再 与 该 酶 的 底 物 反 应 生 成 有 色 产 物 。 借 助 分 光 光 度 计 的 光 吸 收 计 算 抗体 的 量 。 本 方 法 中 采 用 冷 酚 抽 提 法 ， 提 取 并 纯 化 猪 链 球 2 型 菌 的 荚 膜 多 糖 ， 以 其 作 为 包 被 抗 原 ， 建 立 检测 猪 链 球 菌 2 型 抗 体 的 ELISA 检 测 方 法 。4 实 验 条 件4.1 实 验 室 实 验 操
7、作 宜 在 常 温 （ 18 25 ） 进 行 。4.2 仪 器抗 原 包 被 板 、 微 量 移 液 器 、 移 液 器 吸 头 、 酶 标 检 测 仪 、 恒 温 箱 、 冰 箱 。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护 。5 实 验 材 料20 倍 浓 缩 洗 涤 液 、 样 品 稀 释 液 、 酶 标 记 抗 体 、 底 物 液 A、 底 物 液 B、 终 止 液 、 阳 性 对 照 血 清 、 阴性 对 照 血 清 。 配 方 见 附 录 A。 6 样 品 处 理 DB42/T 7892011 2 6.1 样 品 采 集取 动 物 全 血 ， 待 血 液 凝 固 后
8、 ， 4,000 r/min 离 心 10 min， 收 集 上 清 。 要 求 血 清 清 亮 ， 无 溶 血 。6.2 洗 涤 液 配 制使 用 前 ， 将 20 倍 浓 缩 洗 涤 液 恢 复 至 室 温 （ 20 25 ） ， 并 摇 动 使 沉 淀 溶 解 （ 37 水 浴 锅 中 加热 5 min 10 min） ， 然 后 用 蒸 馏 水 稀 释 20 倍 ， 混 匀 ， 稀 释 好 的 洗 涤 液 在 2 8 贮 存 ， 7 d 内 使 用 。6.3 样 品 和 对 照 血 清 稀 释处 理 后 的 样 品 按 1:40 的 比 例 稀 释 ； 阳 性 和 阴 性 对 照 血
9、清 用 样 品 稀 释 液 按 1:40 稀 释 。7 实 验 方 法 7.1 取 抗 原 包 被 板 ， 用 洗 涤 液 洗 板 1 次 （ 200 L/孔 ） 后 在 吸 水 纸 上 拍 干 。7.2 加 入 稀 释 好 的 样 品 ， 每 孔 100 L， 同 时 设 阴 、 阳 性 对 照 孔 ， 每 孔 100 L， 置 37 作 用 30 min。7.3 弃 去 孔 中 的 溶 液 ， 每 孔 加 入 稀 释 好 的 洗 涤 液 200 L， 静 置 3 min 后 ， 弃 去 洗 涤 液 ， 并 在 吸 水 纸 上拍 干 ， 重 复 洗 板 5 次 。7.4 加 入 酶 标 记
10、抗 体 ， 100 L/孔 ， 置 37 作 用 30 min。7.5 弃 去 孔 中 的 溶 液 ， 每 孔 加 入 稀 释 好 的 洗 涤 液 200 L， 静 置 3 min 后 ， 弃 去 洗 涤 液 ， 并 在 吸 水 纸 上拍 干 ， 重 复 洗 板 5 次 。7.6 每 孔 加 底 物 液 A、 底 物 液 B 各 50 L， 混 匀 ， 室 温 避 光 显 色 10 min。7.7 每 孔 加 入 终 止 液 50 L， 混 匀 后 测 定 结 果 。7.8 以 空 白 对 照 孔 调 零 ， 用 酶 标 仪 测 定 各 孔 的 OD 630nm值 。 测 定 结 果 必 须
11、在 加 入 终 止 液 后 10 min 内 完成 。8 结 果 判 定试 验 成 立 的 条 件 是 阳 性 对 照 孔 OD630nm值 0.8， 阴 性 对 照 孔 OD630nm值 0.3。如 果 样 品 OD630nm值 0.35， 判 为 阳 性 ；如 果 样 品 OD630nm值 0.35， 判 为 阴 性 。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施 ， 废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理 。 DB42/T 7892011 3 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）试 剂 的 配 置A.1 样 品 稀 释 液 的 配
12、制脱 脂 乳 50 g氯 化 钠 （ NaCl） 160 g氯 化 钾 （ KCl） 4 g磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO412H2O） 58 g磷 酸 二 氢 钾 （ kH2PO4） 4 gTween-20 5 mL硫 柳 汞 钠 0.1 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL,经 0.22 m 滤 膜 过 滤 后 ， 无 菌 分 装 ， 50 mL/瓶 。A.2 20 倍 浓 缩 洗 涤 液 的 配 制氯 化 钠 （ NaCl） 160 g氯 化 钾 （ KCl ） 4 g磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO412H2O） 58 g磷 酸 二 氢 钾 （
13、 kH2PO4） 4 gTween-20 5 mL加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL,经 0.22 m 滤 膜 过 滤 后 ， 无 菌 分 装 ， 50 mL/瓶 。A.3 酶 标 记 抗 体 的 配 制酶 标 记 抗 体 0.2 mL氯 化 钠 （ NaCl） 160 g氯 化 钾 （ KCl） 4 g磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO412H2O） 58 g磷 酸 二 氢 钾 （ kH2PO4） 4 gTween-20 5 mL硫 柳 汞 钠 0.1 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL,经 0.22 m 滤 膜 过 滤 后 ，
14、无 菌 分 装 ， 20 mL/瓶 。A.4 底 物 液 A 的 配 制磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO4） 14.6 g柠 檬 酸 9.33 g过 氧 化 氢 脲 0.52 g DB42/T 7892011 4 加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL， 调 至 pH 值 至 5.0 5.4,经 0.22 m 滤 膜 过 滤 后 ， 无 菌 分 装 ，12 mL/瓶 。A.5 底 物 液 B的 配 制无 水 乙 醇 10 mL联 苯 二 胺 (TMB) 20 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL， 调 至 pH 值 至 5.0 5.4,经 0.22 m 滤 膜 过 滤 后 ， 无 菌 分 装 ，12 mL/瓶 。A.6 终 止 液 的 配 制氢 氟 酸 （ HF） 6.25 mL， 加 注 射 用 水 至 1000 mL， 经 0.22 m 滤 膜 过 滤 后 ， 无 菌 分 装 ， 12 mL/瓶 。 _
