1、ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 3128.3 2020 群禽腺病毒感染诊断技术 第 3 部分： 血清 4 型群禽腺病毒感染间接 ELISA 诊断技术 Diagnostic techniques for fowl adenovirus group infection Part 3： An indirect ELISA for detection of antibody against fowl adenovirus group serotype 4 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 31
2、28.3 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。 DB37/T 3128.3 2020 1 群禽腺病毒感染诊断技术 第 3 部分：血清 4 型群禽腺病毒感 染间接 ELISA 诊断技术 1 范围 本标准规定了间接酶联免疫吸附试验（ ELISA）检测鸡血清 4型群禽腺病毒抗体的技术规范。 本标准所规定间接酶联免疫吸附试验（ ELISA）适用于鸡血清 4型群禽腺病毒
3、感染抗体的特异 性检 验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 血清 4型群禽腺病毒 Fowl adenovirus group Serotype 4 是引起鸡心包积水 -肝炎综合征的病原，主要造成 3周龄 5周龄鸡突然死亡，并伴随有心包积水和 肝炎。 3.2
4、 一抗 Primary antibodies 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。本标准的一抗为经离心后分离后鸡的血清待检样 品。 3.3 酶标二抗 HRP-labeled secondary antibodies 二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产 生的针对于此抗体的免疫球蛋白，同时用辣根过氧化物酶进行标记的抗体。本标准中的酶标二抗为兔抗 鸡辣根过氧化物酶标记的 IgG，其效价应在 1:32以上。 3.4 血清标准品 DB37/T 3128.3 2020 2 SPF鸡接种血清 4型群禽腺病毒经 PCR检测为阳性后，制备的血清为阳性血
5、清； SPF鸡的血清作为标 准阴性血清， PCR检测结果为阴性。 4 实验室要求 4.1 环境 4.1.1 实验室符合 GB 19489 和 GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全级（ BSL-2级）及以上实 验室。 4.1.2 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品（血液）收集高压灭菌后，送有 资质的医用垃圾处理公司做最终处理。 4.2 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理和血清学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处 理以及熟悉间接 ELISA检测结果的判断方法 。 4.3 仪器设备 4.3.1 台式高速离心机（最大转速为 15000 rpm）。 4.3.
6、2 酶标仪。 4.3.3 微量移液器：最大量程分别为 10 L、 20 L、 100 L、 1000 L。 4.3.4 聚苯乙烯板。 4.3.5 水平振荡器。 4.3.6 恒温培养箱。 4.4 试剂或材料 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682规定的一级水。 4.4.1 阳性血清， SPF鸡接种血清 4型 I群禽腺病毒经 PCR 检测为阳性后，制备的血清。 4.4.2 阴性血清， SPF鸡血清， PCR检测结果应为阴性。 4.4.3 血清 4型 I群禽腺病毒抗原：经浓缩纯化灭活后的全病毒，浓度为 4.68 mg/mL。 4.4.4 酶标二抗：兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的
7、 IgG，效价应在 1:32以上。 4.4.5 磷酸盐缓冲液（ PBS），见附录 A.1。 4.4.6 包被液，见附录 A.2。 4.4.7 洗涤液，见附录 A.3。 4.4.8 样品稀释液（封闭液），见附录 A.4。 4.4.9 底物溶液， TMB底物显色液。 4.4.10 终止液（浓度为 2M），见附录 A.5。 5 样品 5.1 样品的准备与处理 DB37/T 3128.3 2020 3 5.1.1 待检禽血清样品，每份不少于 200 L，无溶血。 5.1.2 用样品稀释液 4.4.8将被检血清样品稀释 10倍（ 1:10，如 10 L血清加入 90 L稀释液中）。 注意：不要稀释对照血
8、清。 5.1.3 确保每个样品换一个吸头，做好样品的标记。稀释的样品血清充分混匀后，加入包被孔。 5.2 样品保存 样品应尽快处理。 5.3 操作步骤 5.3.1 将试验试剂预温到 20 25 。 5.3.2 将全病毒抗原按照浓度为 4.68 g/L用 1碳酸盐缓冲液（ pH9.6）稀释 400倍，每孔 100 L 加入到 96 孔聚苯乙烯板中， 37 孵育 2 h 后，继续 4 孵育过夜。孵育后洗涤液洗 5 次，甩干板上 残余液体。 5.3.3 每孔加入 200 L封闭液， 37 温箱孵育 1 h，用 5.3.2方法洗板。 5.3.4 在 A1、 A2孔各加 100 L阴性血清对照， A3、
9、 A4孔各加 100 L阳性血清对照。 5.3.5 将 100 L稀释好的待检血清加入其他各孔，混匀后， 37 孵育 1 h，用 5.3.2方法洗板。 5.3.6 酶标二抗用样品稀释液按 1:1000倍稀释，每孔加入 100 L， 37 孵育 1 h，用 5.3.2方法洗 板。 5.3.7 每孔加入 100 L TMB 显色液， 37 避光条件下孵育 15 min。 5.3.8 每孔加入 50 L终止液，轻轻振荡，终止反应。 5.3.9 将酶标板置于酶标仪中，于 450 nm测定各孔样品的吸光值（ OD），该操作需在 30 min内完成。 6 结果判定 6.1 阴性对照 OD 均值 =(ODA
10、1+ODA2)/2；阳性对照 OD均值 =(ODA3+ODA4)/2。 6.2 阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于 0.40；阴性对照平均值必须小于等于 0.36， 试验条件成立，否则重复测定。 6.3 阳性样品 OD450 0.40，待检血清为阳性，即已感染血清 4型 I群禽腺病毒。 6.4 阴性样品 OD450 0.36，待检血清为阴性，即未感染血清 4型 I群禽腺病毒。 6.5 可疑样品 0.36 OD450 0.40，判为可疑，重复测定。 DB37/T 3128.3 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） ELISA 试验用溶液的配制 A.1 磷酸盐缓冲液（ PBS， 0.0 1mol/L pH 7.4） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g Na2HPO4 12H2O 0.2 g 水加至 1000 mL A.2 包被液（ 0.05 mol/L pH 9.6） Na2CO3 0.2756 g NaHCO3 0.6216 g 水加至 100 mL A.3 洗涤液 PBS 1000 mL Tween-20 0.5 mL A.4 样品稀释液（封闭液） 脱脂奶粉 5.0 g 洗涤液 100 mL A.5 终止液（ 2M） H2SO4（ 98%） 58 mL 水 442 mL _
