1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 20372012 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子 检测技术规程 Technical Specification of Molecular Detection for Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) Gene 2012 - 02 - 09 发布 2012 - 03 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 20372012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化
2、技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公 司、济南佳宝乳业有限公司。 本标准主要起草人：黄金明、张思聪、鞠志花、李秋玲、李建斌、李荣岭、王长法、赵鲲、侯明海、 曲绪仙、仲跻峰。 DB37/T 20372012 1 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程 1 范围 本标准规定了牛BLAD分子检测的技术方法。 本标准适用于牛BLAD分子检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
3、GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 NY/T 1672 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T 1917-2007 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛白细胞粘附缺陷症（BLAD） 是由常染色体上的白细胞表面整合素（CD18）基因编码区第383位碱基发生AG 错义突变引起的隐 性遗传缺陷病。 4 检测原理 牛BLAD发病原因是由于CD18亚单位编码区的383位碱基由A 突变为G 引起的。基于该点突变设计引 物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序分析，根据DNA测序的
4、峰图及碱基序列比对结果，判断其基因型， 确认是否携带BLAD基因。 5 主要试剂配制 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的双蒸水； 高压灭菌条件为1.03410 5 Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。 6 主要仪器设备 见附录B。 DB37/T 20372012 2 7 检测方法 7.1 样本采集 静脉采集血样35 mL，ACD抗凝，4或-20保存。对公牛，亦可采集23剂细管精液，液氮保存。 7.2 DNA 提取 7.2.1 血液 DNA 的提取 用酚-氯仿抽提法从抗凝血或者血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的预处理按照SN/T 1917-200
5、7 的规定执行。DNA的提取按照 NY/T 1672-2 008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒 提取DNA。 7.2.2 精液 DN A 提取 从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500 L生理盐水，混匀，除去卵黄稀释液及精 清等蛋白成份；12000rpm离心1min，弃除废液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA 抽提液 400 L及5 L蛋白酶K，旋涡混合器悬浮；56消化1012h，至溶液澄清透明；加入300 L苯酚， 轻轻混匀，12000rpm离心10min；吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150 L酚和150 L氯仿，轻轻 混匀5min
6、；吸取上清液，加入500 L无水乙醇（4保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑 出，1mL的70%乙醇洗涤，凉干，加入400 L双蒸水，充分溶解，4或-20保存。 7.2.3 DNA 浓度和纯度检测 按照 NY/T 1672 的规定执行。 7.3 引物序列 上游引物：5-ATTGACAAGGAA AGAAGTCGTTAC-3； 下游引物：5-CTGGCACTCCTT CTCCTTGTT-3。 扩增产物为874bp。 7.4 PCR 扩增 7.4.1 PCR 扩增体系 25L反应体系：10Buffer2.5 L、50mmol/L MgCl2 1.2 L、10mmol/L dNTP 0.6
7、L、Taq DNA聚 合酶2U、10 mol/L引物各1.0 L、模板DNA 50100ng，加双蒸水至总体积25 L。 7.4.2 PCR 扩增循环参数 94预变性5 min；94变性30s，59退火30s，72延伸30s，35个循环；72延伸5min，4保 存。 7.5 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 7.5.1 先用水清洗制胶板，再用 1TAE 冲洗一次，水平放置。 7.5.2 根据电泳胶板的规格和检测样品的数量，配制 1%的琼脂糖溶液，在微波炉中加热融化至溶液澄 清透明，室温下冷却至 60左右时，加入溴化乙锭并混匀，使 EB 的终浓度为 0.5g/mL。 DB37/T 20372012
8、 3 7.5.3 将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子，将凝胶转 移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入 1TAE 缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。 7.5.4 将待检 PCR产物 5 L 和上样缓冲液（6DNA Loading Buffer）以 5:1 的比例混合均匀，加入 点样孔；同时选择点样孔点上 5 L 2000 bp DNA Marker 作参照。恒压 100V，电泳 30min。电泳结束后 于凝胶成像系统观察,并分析记录。 7.6 测序分析 将扩增的PCR产物直接进行测序分析。 8 结果判定 8.1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 牛CD18基因PCR扩
9、增产物仅出现874 bp的条带（图1），则表示扩增特异性好，可进行下一步的测序 分析。 图1 牛 CD18 基因 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱 注：M: DNA marker DL2000； 15: 不同个体的PCR 产物 8.2 结果判定与表述 PCR扩增的CD18基因片段测序结果见附录C。如图2 所示，将PCR产物测序结果利用DNAstar软件进行 比对，CD18 基因PCR扩增产物的第501位碱基为A时，且测序峰图为单峰，表明是纯合基因型AA，该个体 表述为正常牛；第501位碱基为A或G时，且测序 峰图为套峰，表明是基因型AG，属于杂合子，该个体表 述为BLAD携带牛；第501位碱
10、基为G时且测序峰图为单峰，表明基因型是纯合的GG时，该个体表述为BLAD 患病牛。 基因型AA 基因型AG 基因型GG 图2 牛 CD18 基因 PCR 产物测序结果 DB37/T 20372012 4 9 废弃物的处理 按照NY/T 1672 的规定执行。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T 1193 的规定执行。 DB37/T 20372012 5 A A 附 录 A （资料性附录） 主要试剂配制 A.1 ACD抗凝剂：柠檬酸 0.48g、柠檬酸钠 1.32g、葡萄糖 1.47g，定容于 100mL水中，高压灭菌。 A.2 10%SDS(十二烷基硫酸钠)：100g SDS溶于
11、 90mL水中，加热至 68助溶，用HCl调pH至 7.2，定容 至 1000mL，0.2m的滤膜过滤，高压灭菌。 A.3 PBS（磷酸盐缓冲液） ：8g NaCl、0.2g KCl、 1.44g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4 溶于 800mL蒸馏水中， 用HCl调pH值到 7.4，加水定容至 1L，高压灭菌，室温保存。 A.4 0.5mol/L NaCl（氯化钠） ：5.844g NaCl溶于水中，加水定容至 200mL，高压灭菌。 A.5 蛋白酶K(20mg/mL) 200mg蛋白酶K溶于10mL水中，以1mL分装，-20冷冻保存。 A.6 氯仿:异戊醇（24:1） ：异戊醇
12、 21mL加入到 500mL氯仿试剂瓶中，混匀。 A.7 1mol/L Tris.HCl(pH=8.0)：将 121.1g Tris溶于 800mL水中，加浓盐酸调pH至 8.0，定容至 10 00 mL，高压灭菌。 A.8 0.5mol/L EDTA(pH8.0)： 800mL水中加入 186.1g EDTA-Na22H2O（二水合乙二胺四乙酸二钠） ，在 磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH至8.0，然后定容至 1L，高压灭菌。 A.9 TE缓冲液 取1mol/L Tris.HCl（pH 8.0）10mL，0.5mol/L EDTA （pH 8.0）2mL，加水定容至1L，高压 灭
13、菌，室 温保存。 A.10 血样裂解液 1mol/L Tris-HCl(pH=8.0)1mL，0.5mol/L EDTA(pH=8.0)20mL，10%SDS 5mL，双蒸水 74mL。 A.11 精子DNA抽提液 称取二硫苏糖醇0.06g与1mL 0.5 mol/L Tris.Cl，0 .5mol/L EDTA, 5mol/L NaCl, 2ml 10% SDS混合 后，补水至10mL。 A.12 10mg/mL溴化乙锭 DB37/T 20372012 6 在10mL水中加入100mg的溴化乙锭（EB），溶解后分装成1mL小份，4保存。 A.13 50TAE缓冲 液 Tris.base 24
14、2g，冰乙酸57.1mL，0.5mol /L EDTA (pH8.0)100mL，加水定容 至1000mL 。 A.14 1%琼脂糖 1g琼脂糖充分溶解于1TAE，最后定容至100mL。 A.15 琼脂糖电泳上样缓冲液 0.25%溴酚兰；0.25%二甲苯菁FF；40%的蔗糖水溶液。 DB37/T 20372012 7 B B 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 B.1 单道可调移液器 2L，10L，20L，100L，200L，1000L。 B.2 基因扩增仪 温度范围4-99,温度梯度范围20,模块单元960.2mL。 B.3 离心机 最高转速12000r/min，最大容量241.5mL
15、。 B.4 恒温振荡器 0r/min -200r/min，0-60。 B.5 电子天平 量程0.001g-100g，感量0.001g。 B.6 旋涡混合器 转速2800r/min，工作台直径110mm。 B.7 手持式均质器 转速范围5000-35000rpm，处理量0.05-100mL。 B.8 紫外分光光度计 波长范围200-1000nm。 B.9 凝胶成像分析系统 有效像素1280*1024，检测灵敏度DNA 0.05ng。 B.10 稳压稳流电泳仪 DB37/T 20372012 8 输出电压0-600V，输出电流0-100mA。 B.11 水平电泳槽 外形尺寸182mm85mm5mm
16、，凝胶板面积60mm60mm。 B.12 高压灭菌锅 使用温度范围45-135，最高使用压力0.255Mpa。 B.13 自动双重纯水蒸馏器 功率3000W，出水量2500mL/h。 B.14 微波炉 容积20L，尺寸262mm 452mm365mm。 B.15 干燥箱 温控范围50-300，箱内尺寸350 *350*450mm。 B.16 冰箱 4,-20。 DB37/T 20372012 9 C C 附 录 C （规范性附录） PCR 扩增的奶牛 CD18 基因序列 C.1 PCR扩增的奶牛CD18 基因序列 1 ATTGACAAGG AAAGAAGTCG TTACAAGTGC AGGTG
17、GTGAT TAAGATGACG AGGAGCAGAA 61 ACTAGGGCAG CTGGGATTGA GGAAGTGGGG GGGGGTGTCC CAGGATGGCC AGGGAGCCCT 121 TTTGGGGCCC TGGCAGTTTG CTTAGCAGCT GGTGGTAGAG AAGGCCTTAC CAGAGAGACC 181 AGAGAGATAG TAGAATGATT AACAGTGTGA TAACATGACA CTCTATATCT CTGTATCCAG 241 CACATATGTA TCCAGATGTT TCTATGTCAG AACGTGTGCT TGCCTGAAAT GGAA
18、TCTGAA 301 TAGGCATCCT GCATCATATC CACCAGCATA AGAGAATGGG GAGAGTCCTG AGGTTCTGAG 361 GCCTGACAAG ATGCCATAAG TGCCCATGAA CCCCCCCCAC CCCCAGACCA GATAGTACAC 421 CCTGACTATC TCCCAAATCC TGGCAGGTCA GGCAGTTGCG TTCAACGTGA CCTTCCGGAG 481 GGCCAAGGGC TACCCCATCG A/GCCTGTACTA CCTGATGGAC CTCTCCTACT CCATGGTGGA 541 TGACCTC
19、GTC AACGTCAAGA AGCTGGGGGG TGACCTGCTC CGGGCCCTCA ATGGCATCAC 601 CGAGTCGGGC CGCATTGGTG AGGCAGCTAC TCCATCTTCC CCTGAAACCC CAAGCCCCGG 661 TCCCAGGCAC CTCTGCACCT CTGCACCCCA AGGGCAGGGC GCCAGGCCCC TCCCCACGTG 721 CCGGGCCTTC CTACCCCTCT CTGGTAAGAG GCTCACGGCC CCTCACTGTC CCCCAGGTTT 781 CGGGTCCTTC GTGGACAAGA CGGTGCTCCC CTTCGTCAAC ACGCACCCCG AGAAGCTGCG 841 GAACCCCTGC CCCAACAAGG AGAAGGAGTG CCAG 注： A/G 表示扩增片段的第501位点SNP突变 _
