1、ICS 65.020 B 04 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3802 2019 花生品种鉴定技术规程 SSR 标记法 Protocol for identifying peanut variety SSR marker method 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3802 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省花生研究所 。 本标准主要起草人：闫
2、彩霞、单世华、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。 DB37/T 3802 2019 1 花生品种鉴定技术规程 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（ Simple sequence repeat， SSR）标记法进行花生（ Arachis hypogaea L.）品种鉴定的术语与定义、仪器设备、试剂与溶液配制、引物信息、鉴定方法、数据读取 与判定方法。 本标准适用于花生品种的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引 用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
3、GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 NY/T 2237 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 花生 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单重复序列 simple sequence repeat， SSR 由几个核苷酸（ 1 6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个 bp（一般为 100 200）的串联 重复序列 ，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。 3.2 推荐引物 recommended prim
4、er 根据最少引物区分最多品种的原则筛选出的一套 SSR引物，具有条带清晰、多态性高、重复性好、 均匀分布的特点，用于 DNA分子数据的采集和品种鉴定。 3.3 参照品种 reference variety 具有推荐 SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异扩增片段的大小， 校正仪器设备的系统误差。 4 仪器设备 DB37/T 3802 2019 2 所用仪器设备见附录 A。 5 试剂、溶液配制及引物信息 5.1 试剂及溶液配制 试剂及溶液 配制见附录 B（除特殊说明外，所用试剂均为分析纯）。 5.2 引物信息 推荐引物的相关信息见附录 C。 6 鉴定方法 6.1 样
5、品准备 6.1.1 样品为花生种子及其他植物组织。种子样品的分样和保存，按照 GB/T 3543.2 的规定执行。 6.1.2 每份样品中至少随机抽取 10个个体，每个个体单独分析。如样品为种子，水培法种植，至第三 片真叶长出后备用。参照品种（见附录 D）各种植 2粒，混合分析。 6.2 样品的 DNA 提取 6.2.1 DNA 提取 取花生幼嫩组织 50 mg，放入组织破碎仪中，液氮研磨。十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）法提取基 因组 DNA，室温风干，加入 100 L 1 TE（ pH8.0）溶液溶解 DNA。完全溶解后每管加入 5 L RNAase， 37 温育 1 h， 20 下保存
6、留用。 6.2.2 DNA 浓度和质量检测 利用 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性， Gold View染料进行染色。测定 DNA溶液的 OD260/OD280值， 在 1.8 2.0范围内最佳。测定其 OD260的吸光度，以 1个 OD260值相当于 50 mg/L DNA浓度来计算 DNA的浓度。 稀释至工作浓度为 30 ng/ L，置于 4 下备用。 6.3 PCR 扩增 6.3.1 参照品种的使用 在进行 PCR扩增和等位基因检测时，不同 SSR引物的参照品种参见附录 C。 6.3.2 反应体系 总体系为 10 L，包括 4.5 ng/ L DNA， 0.8 mol/L F/
7、R引物， 1 Dream Taq Green PCR Master Mix， 1.9 L蒸馏水，混匀。 6.3.3 反应程序 95 预变性 3 min； 95 变性 45 s， 55 退火 45 s， 72 延伸 45 s，进行 35个循环； 72 延伸 5 min； 4 下保存备用。 6.4 PCR 产物检测 DB37/T 3802 2019 3 6.4.1 玻璃板组装 清洗玻璃板和样品梳，晾干。用无水乙醇擦拭凹板和平板各 2遍，待玻璃板彻底干燥后，将 1.0 mm 厚的塑 料边条整齐摆放在平板两侧，盖上凹板，对齐，夹紧，用水平仪调平。 6.4.2 制胶 根据凝胶的面积和数量，调整 6%聚丙
8、烯酰胺凝胶溶液的用量，分别加入 1 的 APS和 1 的 TEMED， 轻轻摇匀，防止产生气泡，迅速灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，在上部凹面处轻轻插入样品梳平端，深 度约 0.8 cm。室温下静置 1 h，使胶液聚合，如室温较低可适当延长聚合时间。 6.4.3 电泳准备 将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入 1 TBE缓冲液，至下槽液面约为槽 高的 1/3，上槽液面高于玻璃板凹面约 1 cm。拔去梳子，冲洗胶孔，清除底 层气泡和杂质。将样品梳齿 端插入凝胶 1 mm 2 mm处。 6.4.4 上样 PCR产物中加入 1/6体积的 6 loading buffer，微量移液器上
9、样，每孔加入 2 L PCR扩增产物（上 样量可根据加样孔的大小适当调整）。 20 bp DNA Ladder分子量标记加入两侧加样孔中，对应参照品种 的 PCR产物加入中间加样孔中，检测样品 PCR产物加入其余加样孔中。 6.4.5 电泳 电压为 200 V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示带到达胶板底部，停止电泳， 电泳时间一般为 2 h。 6.5 银染显色 6.5.1 水洗 电泳结束后，分开两块玻璃 板，取出凝胶，用蒸馏水快速漂洗 2次，不超过 10 s。 6.5.2 银染 将凝胶转移至适量染色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇 10 min。 6.5.3 水洗 将凝胶从染色
10、液中取出，在蒸馏水中快速漂洗 2次，时长 8 s 10 s。 6.5.4 显影 将凝胶转移至适量显色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇至带纹清晰。 6.5.5 漂洗 将凝胶转移到蒸馏水中清洗，直至蒸馏水澄清。 6.6 成像 将凝胶置于凝胶成像系统的工作台上，选用透射紫外光观察，调节至图像最清晰，保存。 DB37/T 3802 2019 4 7 数据读取与判定方法 7.1 数据读取 利用凝胶分析软件 Quantity one读取条带，每个 SSR位点的等位 变异大小用扩增片段长度表示，单 位为 bp。与对应的参照品种进行比较，校正系统误差，确定送检样品在每个位点的等位变异大小，获得 送检样品 27
11、个 SSR位点的指纹图谱。 7.2 判定方法 根据送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数，对送检样品进行鉴定。 当送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数 2，则判定为“不同品种”； 当差异位点数 =1，判定为“近似品种”； 当差异位点数 =0，判定为“疑同品种”。 对于差异位点数 1个的送检样品，应按 GB/T 19557.1给出的原则和 NY/T 2237给出的方法进行田间 测试，确定送检样品 在表型性状上是否与对应品种一致。 DB37/T 3802 2019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 仪器设备 A.1 组织破碎仪 温控范围为 40 室温。 A.2 高压灭菌锅 灭菌温度为 10
12、5 136 ，最大工作压力为 0.22 MPa。 A.3 凝胶成像系统 分辨率不低于 400百万像素。 A.4 高速冷冻离心机 最大离心力不小于 15 000 g。 A.5 PCR扩增仪 控温范围为 0 100 。 A.6 紫外可见分光光度计 波长范围为 190 nm 1 100 nm。 A.7 恒温水浴锅 温度范围为室温 99 。 A.8 水平摇床 转速为 0 rpm 230 rpm。 A.9 微波炉 最高耐温 120 。 A.10 电子天平 DB37/T 3802 2019 6 精确到 0.01 g。 A.11 电泳槽 样品通量为 1.0 mm厚。 A.12 磁力搅拌器 转速为 0 r/m
13、in 2 500 r/min，控温范围为室温 100 。 A.13 酸度计 测量范围为 0.00 pH 14.00 pH。 A.14 微量移液器 量程分别为 2 L、 10 L、 100 L、 200 L、 500 L和 1 000 L。 DB37/T 3802 2019 7 B B 附 录 B （规范性附录） 试剂及溶液配制 B.1 试剂 B.1.1 乙二胺四乙酸钠（ EDTA-Na2）。 B.1.2 三羟基甲基氨基甲烷（ Tris）。 B.1.3 盐酸（ HCl， 36 %）。 B.1.4 十六烷 基三甲基溴化铵（ CTAB）。 B.1.5 氯化钠（ NaCl）。 B.1.6 硼酸（ Bo
14、rate）。 B.1.7 丙烯酰胺。 B.1.8 甲叉双丙烯酰胺。 B.1.9 四甲基乙二胺（ TEMED）。 B.1.10 无水乙醇。 B.1.11 过硫酸铵（ APS）。 B.1.12 硝酸银（ AgNO3）。 B.1.13 琼脂糖。 B.1.14 6 loading buffer。 B.1.15 Gold View染料。 B.1.16 RNAase（ 10 mg/mL）。 B.1.17 酚 :氯仿 :异戊醇（体积比 25:24:1）。 B.1.18 异丙醇。 B.1.19 四硼酸钠。 B.1.20 甲醛。 B.1.21 2 Dream Taq Green PCR Master Mix。
15、B.1.22 SSR引物（ 10 mol/L）。 B.1.23 20 bp DNA Ladder。 B.1.24 重蒸水或符合 GB/T 6682规定的一级水 . B.2 溶液配制 B.2.1 1mol/L NaOH 4 g NaOH，加蒸馏水定容至 100 mL。 B.2.2 1mol/L Tris-Cl（ pH8.0）溶液 称取 121.1 g Tris，加蒸馏水定容至 1 L，浓盐酸调至 pH8.0，高压灭菌备用。 B.2.3 0.5mol/L EDTA（ pH8.0）溶液 DB37/T 3802 2019 8 称取 186.1 g EDTA-Na2， 800 mL蒸馏水，加热定容至 1
16、 L， 1 mol/L NaOH调至 pH8.0，高压灭菌备用。 B.2.4 1 TE 1 mL 1 mol/L Tris-HCl（ pH8.0）， 0.2 mL 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0），加蒸馏水定容至 100 mL。 B.2.5 DNA提取液 4 g CTAB， 16.364 g NaCl， 20 mL 1 mol/L Tris-Cl（ pH8.0）， 8 mL 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0）， 加蒸馏水定容至 200 mL， 4 条件下保存。使用前加入 2 %的巯基乙醇，实验前预热至 65 。 B.2.6 70 %乙醇 700 mL无水乙醇，加蒸馏水定容
17、至 1 L。 B.2.7 10 TBE缓冲液 分别称取 108 g三羟基氨基甲烷， 55 g硼酸，加入 800 mL蒸馏水 加热溶解，再加入 0.5 mol/L EDTA （ pH8.0）溶液 37 mL，加蒸馏水定容至 1 L。 B.2.8 1 TBE缓冲液 100 mL 10 TBE，加蒸馏水定容至 1 L。 B.2.9 10 %APS 0.5 g APS溶于 5 mL蒸馏水中。 B.2.10 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液（ 29:1） 分别称取 58 g丙烯酰胺， 2 g甲叉双丙烯酰胺， 100 mL 10 TBE，加蒸馏水定容至 1 L， 4 条件下 保存。 B.2.11 染色液 称取 1
18、 g硝酸银，加蒸馏水定容至 1 L。 B.2.12 显色液 6 g NaOH， 0.2 g四硼酸钠， 1.6 mL甲醛，加蒸馏水定容至 400 mL。 DB37/T 3802 2019 9 C C 附 录 C （资料性附录） 推荐引物 推荐引物见表 C.1。 表 C.1 推荐引物 引物 连锁群 引物序列（ 53 ） 常见等位变异（ bp） 参照品种 Ah1TC5A06 A07 F-tcggtttgggagacactctt R-ttgtaagcagacgccacatc 160 zh.h2461 162 zh.h5075 164 166 zh.h2406 zh.h1961 168 zh.h0949
19、 172 zh.h2250 176 zh.h2405 180 zh.h2764 188 zh.h0537 Ah2TC11H06 B04 F-ccatgtgaggtatcagtaaagaaagg R-ccaccaacaacattggatgaat 168 zh.h2413 174 zh.h2499 182 zh.h5399 198 zh.h0930 202 zh.h2405 206 zh.h2764 210 zh.h4749 Ah3TC23C08 B06 F-agcagagtggaaaacgaagaag R-gtcagtttgtgaatcgggtttt 89 zh.h4749 91 zh.h503
20、4 93 zh.h2406 99 zh.h0861 101 zh.h1797 103 zh.h1585 AHGS0138 B10 F-catattgacggtgatggcag R-ccgaccctaatcctaatacaaca 150 zh.h5060 154 zh.h2462 162 zh.h2405 164 zh.h2682 168 zh.h5034 174 zh.h2069 DB37/T 3802 2019 10 表 C.1 推荐引物 （续） 引物 连锁群 引物序列（ 53 ） 常见等位变异（ bp） 参照品种 AHGS0151 A05 F-agcaaatgaaggtgagggtg R-
21、gcccaaaaatgctaacgaag 65 zh.h2330 68 zh.h2413 90 zh.h2250 108 zh.h2405 112 zh.h2591 115 zh.h5075 118 zh.h5034 AHGS0599 未定位 F-agattggtggtgacagaggc R-gccatcgatgtaaccctcac 233 zh.h0949 236 zh.h5399 253 zh.h2250 260 zh.h0525 263 zh.h2405 266 zh.h2466 GM1843 未定位 F-cccacacacacacacacacta R-aggtgatgctgcgtttc
22、ttt 66 zh.h2231 74 zh.h1585 82 zh.h0531 86 zh.h2250 90 zh.h2608 94 zh.h2462 GM1996 B03 F-catcccatcattttccctctt R-tacagtgaaggtgggatcctg 77 zh.h5034 85 zh.h5327 87 zh.h1395 89 zh.h2764 92 zh.h2405 GM2638 A04 F-atgctctcagttcttgcctga R-cagacataacagtcagtttcacc 45 zh.h1689 55 zh.h2702 57 zh.h2384 63 zh.h4
23、749 65 zh.h5327 69 zh.h2250 73 zh.h0949 GNB357 未定位 F-aggtttgctttgggatgatg R-ccgataaaaccaggcaagaa 191 zh.h5034 194 zh.h1602 197 zh.h2406 203 zh.h0537 215 zh.h0861 218 zh.h1331 DB37/T 3802 2019 11 表 C.1 推荐引物 （续） 引物 连锁群 引物序列（ 53 ） 常见等位变异（ bp） 参照品种 GNB317 未定位 F-gaaaagcttgcaaaatcgaga R-tccttccatgttggtgaa
24、tg 188 zh.h2550 194 zh.h0540 197 zh.h2561 200 zh.h2405 203 zh.h2764 212 zh.h5034 224 zh.h2462 227 zh.h0537 230 zh.h4749 GNB556 A01 F-tcagggtgggttaccaacat R-taatccacattgaaccgacg 56 zh.h0525 62 zh.h0934 68 zh.h2413 71 zh.h2410 77 zh.h0868 80 zh.h2231 86 zh.h1331 PM308 未定位 F-ccttcttctttctcctcctca R-caa
25、ttcgtgatagtattttattggaca 64 zh.h5034 74 zh.h4749 78 zh.h0977 80 zh.h2764 82 zh.h2464 86 zh.h2405 92 zh.h0680 pPGSseq19D6 B05 F-tttgttatgctcacacccca R-aaaaatgaagcaatattttgttgttag 180 zh.h4779 192 zh.h2406 200 zh.h2508 204 zh.h0537 210 zh.h5034 pPGPseq2C11 A03 F-tgacctcaattttggggaag R-gccactattcatcgcg
26、gta 385 zh.h2456 403 zh.h2764 418 zh.h4749 439 zh.h2405 450 zh.h2406 461 zh.h0436 Ah2TC7C06 A06 F-ggcaggggaataaaactactaact R-ttttccttccttctcctttgtc 130 zh.h2405 134 zh.h2764 142 zh.h2413 144 zh.h5098 146 zh.h2250 DB37/T 3802 2019 12 表 C.1 推荐引物 （续） 引物 连锁群 引物序列（ 53 ） 常见等位变异（ bp） 参照品种 Ah3TC20B05 A08 F-
27、gcatgtaaactatgcaatcgct R-caacaacttattccaccaaatatca 64 zh.h5034 72 zh.h2406 76 zh.h2462 84 zh.h5327 86 zh.h0861 Ah590 B03 F-caaaacgcaatgcaaggtacg R-acgaacgtgcagcaagaagaag 144 zh.h5060 162 zh.h0949 180 zh.h2405 190 zh.h0764 194 zh.h2250 200 zh.h0977 AHS2037 A10 F-tggccttgattactctcgct R-acaggggtctggagg
28、aagtt 312 zh.h2405 318 zh.h1315 321 zh.h4749 327 zh.h5034 342 zh.h5075 Ai119F10 B05 F-tggcaattgattagagattaga R-cagaagaggtgggagaga 222 zh.h2405 226 234 238 254 zh.h1602 zh.h4749 zh.h0537 zh.h0099 GNB320 未定位 F-gaattcctggctcgaacttg R-acccctccatttcgtcttct 332 zh.h2462 334 zh.h2177 336 zh.h4749 342 zh.h0
29、977 GNB329 未定位 F-ccctttttcgctttcttcct R-gttctcgtttgtgccctctc 208 zh.h2764 211 zh.h0977 217 zh.h2405 223 zh.h5060 238 zh.h1315 PM210 B06 F-ccgcagatcttctcctgtgt R-cctcctcatcctctaaactctgc 179 zh.h2208 183 zh.h2562 187 zh.h2425 193 zh.h5030 196 zh.h5365 201 zh.h2426 DB37/T 3802 2019 13 表 C.1 推荐引物 （续） 引物
30、 连锁群 引物序列（ 53 ） 常见等位变异（ bp） 参照品种 IPAHM23 B08 F-gtgtcttttcgttcgcgatt R-cgactcttagggtggattatagtaaga 59 zh.h2405 74 zh.h2462 77 zh.h2069 PM358 A07 F-ccacaaacagtgcagcaatc R-tcaaaggccatttcatcaca 138 zh.h1816 141 zh.h2561 143 zh.h2413 149 zh.h4673 PM375 未定位 F-cggcaacagttttgatggtt R-gaaaaatatgccgccgttg 100
31、 zh.h4749 110 zh.h0861 150 zh.h2406 152 zh.h2076 pPGPseq2D12B B02 F-aagctgaacgaactcaaggc R-tgcaatgggtacaatgctaga 288 zh.h2764 294 zh.h0102 300 zh.h2405 318 zh.h0537 330 zh.h0678 DB37/T 3802 2019 14 D D 附 录 D （资料性附录） 参照品种名单 参照品种名单见表 D.1 表 D.1 参照品种名单 序号 种质库统一编号 品种名称 序号 种质库统一编号 品种名称 1 zh.h0099 赣榆小站秧 34
32、 zh.h2384 英德白沙鸡豆仔 2 zh.h0102 启东赤豆花生 35 zh.h2405 试花 1 号 3 zh.h0436 蒲 庙花生 36 zh.h2406 试花 3 号 4 zh.h0525 锦交 1 号 37 zh.h2410 博山站秧子 5 zh.h0531 滕县滕子花生 38 zh.h2413 沂南小麻叶 6 zh.h0537 巨野小花生 39 zh.h2425 嘉祥长秧 7 zh.h0540 栖霞爬蔓小花生 40 zh.h2426 沂南大铺秧 8 zh.h0678 托克逊小花生 41 zh.h2456 郑 72-5 9 zh.h0680 北京大粒墩 42 zh.h2461
33、长垣一把抓 10 zh.h0764 昆嵛大粒 墩 43 zh.h2462 濮阳 837 11 zh.h0861 反修 1 号 44 zh.h2464 濮阳二糙 12 zh.h0868 栖霞半糠皮 45 zh.h2466 王屋花生 13 zh.h0930 莱芜蔓 46 zh.h2499 南江大花生 14 zh.h0934 夏津小二秧 47 zh.h2508 南溪二郎子 15 zh.h0949 牟平大粒蔓 48 zh.h2550 霸王鞭 -1 16 zh.h0977 汶上蔓生 49 zh.h2561 潜山大果 17 zh.h1315 发财生 50 zh.h2562 宿松土花生 18 zh.h133
34、1 柳城筛豆 51 zh.h2591 邵东中扯子 19 zh.h1395 花 33 52 zh.h2608 大埔种 20 zh.h1585 洪洞花生 53 zh.h2682 岑巩藤花生 21 zh.h1602 辽中四粒红 54 zh.h2702 锦交四号 22 zh.h1689 青川小花生 55 zh.h2764 早熟红粒 23 zh.h1797 鄂花 5 号 56 zh.h4673 秭归磨坪红皮花生 24 zh.h1816 金寨蔓生 57 zh.h4749 赣花 2326 25 zh.h1843 茶陵打子 58 zh.h4779 汕油 523 DB37/T 3802 2019 15 表 D.
35、1 参照品种名单 (续 ) 序号 种质库统一编号 品种名称 序号 种质库统一编号 品种名称 26 zh.h1961 狮油红 4 号 59 zh.h5030 小河大花生 27 zh.h2069 狮头企 60 zh.h5034 沙洋 3527 28 zh.h2076 西农 3 号 61 zh.h5060 岳西大花生 29 zh.h2177 永宁小花生 62 zh.h5075 檀头六月籽 30 zh.h2208 沂南 四粒糙 63 zh.h5098 三号仔 31 zh.h2231 大伏抚罗 1 号 64 zh.h5327 群育 161 32 zh.h2250 抚沟罗油 6 号 65 zh.h5365 经花 14 号 33 zh.h2330 全州凤凰花生 66 zh.h5399 经花 48 号 _
