1、ICS 65.020.01 B 05 DB37 山东省 地方标准 DB 37/T 3801 2019 花生品种纯度鉴定技术规程 SSR 标记法 Protocol of purity identification for peanut variety using SSR markers 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3801 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 2 5 仪器设备 . 2 6 试剂 . 2 7 溶液配制 . 2 8
2、 引物信息 . 2 9 操作步骤 . 2 9.1 样品准备 . 2 9.2 单粒种子的 DNA提取 . 2 9.3 PCR扩增 . 3 9.4 PCR产物检测 . 3 10 判定方法与原则 . 4 10.1 判定方法 . 4 10.2 判定原则 . 4 附录 A（规范性附录） 溶液配制 . 5 附录 B（资料性附录） 推荐引物 . 7 附录 C（资料性附录） 参照品种名单 . 9 DB37/T 3801 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化委员会归口。 本标准起草单位：山东省 花生研究
3、所。 本标准主要起草人：单世华、闫彩霞、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。 DB37/T 3801 2019 1 花生品种纯度鉴定技术规程 -SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（ Simple sequence repeat， SSR）标记法进行花生（ Arachishypogaea L.）品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、操作步骤、判定方法与原则。 本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用 文件，其最新版本（包括所有的修改单）
4、适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种纯度 Variety purity 品种在 SSR标 记带型 上 典型一致的程度，反映鉴定品种的特征特性。 3.2 简单重复序列 Simple sequence repeat（ SSR） 由几个核苷酸（ 1 6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个 bp（一般为 100 200）的串联 重复序列，又称微卫星序列或短串联重 复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。 3.3 推荐引物 Recommended primer
5、 根据最少引物区分最多品种的原则，筛选出多态性高，条带清晰、重复性好的一套 SSR引物。 3.4 参照品种 Reference variety 具有推荐 SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备 的系统误差。 DB37/T 3801 2019 2 4 原理 不同花生品种由于遗传组成不同，基因组中重复单位的数目存在差异，造成了品种间的多态性。可 根据其两端的高度保守序列设计特异引物，通过 PCR扩增及电泳检测，从而鉴定花生品种 的 纯度 。 5 仪器设备 高压灭菌锅（ 105 136 ，最大工作压力 0.22 MPa）；凝胶自动扫描仪（ 400百万像素）；
6、高 速冷冻离心机（最大离心力不小于 15000 g）； PCR扩增仪（ 0 100 ）；紫外分光光度计（波长 190 nm 1100 nm）；恒温水浴锅（室温 99 ）；水平摇床（ 0 rpm 230 rpm）；微波炉（耐温 120 ）； 电子天平（最小显示 0.01 g）；电泳槽（样品通量 1.0 mm厚）；磁力搅拌器（ 0 r/min 2500 r/min， 室温 100 ）；酸度计（ -2.00 20.000 pH）；微量移液器（ 2 l、 10 l、 100 l、 200 l、 500 l 和 1000 l）。 6 试剂 乙二胺四乙酸钠（ EDTA-Na2）；三羟基甲基氨基甲烷（ Tr
7、is）；盐酸（ HCl， 36 %）；十六烷基三 甲基溴化铵（ CTAB）；氯化钠（ NaCl）；硼酸（ Borate）；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；四甲基乙二胺 （ TEMED）；无水乙醇；过硫酸铵（ APS）；硝酸银 （ AgNO3） ；琼脂糖； 6loading buffer； Gold View 染料； RNAase（ 10 ugL-1）；酚 :氯仿 :异 戊醇（体积比 25:24:1）；异丙醇；四硼酸钠；甲醛； 2Frements Mix； SSR引物（ 10 molL-1）； 20 bp DNA Ladder；重蒸水或符合 GB/T 6682规定的一级水。除特殊说 明外，所用试剂均为
8、分析纯试剂。 7 溶液配制 相关溶液配制方法见附录 A。 8 引物信息 推荐引物的序列信息与等位变异见附录 B。 9 操作步骤 9.1 样品准备 鉴定样品的分样和保存，应符合 GB/T 3543.2的规定 。 随机取 100粒花生种子，取其父母本材料各 10 份，另取参照品种（见附录 C）各 2粒。水培法种植，至第三片真叶长 出后备用。 9.2 单粒种子的 DNA 提取 9.2.1 DNA 提取 取单株幼苗的根、茎、叶等器官 50 mg，放入 1.5 mL离心管中，液氮研磨。 CTAB法提取基因组 DNA， 加入 100 l 1TE（ pH 8.0）溶液溶解 DNA。完全溶解后 每管 加入 5
9、 l RNAase， 37 温育 1 h， 20 保存留用。 DB37/T 3801 2019 3 9.2.2 DNA 浓度和质量检测 测定 DNA溶 液的 OD260/OD280值，确保在 1.7 2.0范围内。测定其 OD260的吸光度，以 1个 OD260值相当于 50 mgL-1 DNA浓度来计算纯化 DNA的浓度。用 0.8 %琼脂糖凝胶电 泳检测 DNA完整性， Gold View染料进行染 色。稀释至工作浓度为 30 ngL-1，置于 4 备用。 9.3 PCR 扩增 9.3.1 反应体系 总体系为 10 L，包括 1.5 L DNA， 1.9 L水， 5 L 2Frements
10、 Mix， 0.8 L F/R引物，混匀。 9.3.2 反应程序 95 预变性 3 min； 95 变性 45 s， 55 退火 45 s， 72 延伸 45 s，进行 35个循环； 72 延伸 5 min； 4 保存备用。 9.4 PCR 产物检测 9.4.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶制备 9.4.1.1 玻璃板组装 清洗玻璃板和 52齿梳，晾干；用 95 %乙醇擦凹板和平板，两板间插入 1.0 mm厚的边条，对齐，夹紧， 凹板朝上，水平放置，用水平仪调平。 9.4.1.2 灌胶 在小烧杯中加入 7.5 mL 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液、 37 mL水，然后加 500 L 10 %APS及 20
11、L TEMED， 轻轻摇匀，防止产生气泡；迅速灌胶，将梳子齿朝外，轻轻插入胶中，至凹板玻璃面约 0.8 cm处，静置 1 h。 9.4.2 电 泳检测 9.4.2.1 玻璃板 组 装 将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入 1TBE缓冲液，至下槽液面约为槽 高的 1/3，上槽液面高于凹板玻璃面约 1 cm。 9.4.2.2 清洗胶孔 拔去梳子，冲洗胶孔，赶走底层气泡和杂质。 9.4.2.3 上样 在 10 L PCR产物中加入 2 L 6loading buffer，用微量移液器上样，每孔加入 2 L PCR扩增产 物；同时，在两侧样品孔中加入 20 bp DNA Ladde
12、r分子量标记。 9.4.2.4 电泳 电压为 200 V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示剂到达胶板的 2/3处，停止电泳， 电泳时间约 2 h。 9.4.3 银染显色 DB37/T 3801 2019 4 9.4.3.1 水洗 电泳结束后，分开两块玻璃板取出凝胶，用水漂洗 10 s 20 s，重复 2次。 9.4.3.2 银染 转移至 400 mL 0.1 % AgNO3溶液 中，在摇床上轻摇 10 min。 9.4.3.3 水洗 从染色液中取出，在水中快速漂洗 2次，时长 8 s 10 s。 9.4.3.4 显影 转移至 400 mL显色液中，在摇床上轻摇至带纹清晰 ， 用水
13、冲洗至溶液澄清。 9.4.3.5 成像 将凝胶置于凝胶成像工作台，选用透射 UV光，调节 focus至图像最清晰，保存。 10 判定方法与原则 10.1 判定方法 每个 SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示，利用凝胶分析软件 Quantity one读取条带。 比较每份样品在每个位点的等位变异，统计带型。用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒 数的百分率表示纯度，计算公式如式 1： % = 1 0 0 %具 有 本 品 种 特 异 带 型 的 种 子 粒 数纯 度 检 测 样 品 种 子 粒 数 . (1) 10.2 判定原则 如差异位点数 =0，则说明该品种纯度为 100
14、%，判定为 “单一品种” ；如差异位点数 =1，判定为 “姊 妹系” 或 “基本稳定品种” ；如差异位点数 2，则判定为 “混合样品” 。 DB37/T 3801 2019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 DNA提取试剂 A.1.1 1molL-1 NaOH 4 g NaOH，加水定容至 100 mL。 A.1.2 1molL-1 Tris-Cl（ pH 8.0）溶液 称取 121.1 g Tris，加水定容至 1 L，浓盐酸调至 pH 8.0，高压灭菌备用。 A.1.3 0.5molL-1 EDTA（ pH 8.0）溶液 称取 186.1 g EDTA-Na2， 8
15、00 mL水，加热定容至 1 L， 1 molL-1 NaOH调至 pH 8.0，高压灭菌备用。 A.1.4 1TE 1 mL 1 molL-1 Tris-HCl（ pH 8.0）， 0.2 mL 0.5molL-1 EDTA（ pH 8.0），加水定容至 100 mL。 A.1.5 DNA提取液 4 g CTAB， 16.364 g NaCl， 20 mL 1molL-1 Tris-Cl（ pH 8.0） ， 8 mL 0.5 molL-1 EDTA（ pH 8.0）， 加水定容至 200 mL， 4 条件下保存。使用前加入 2 %的巯基乙醇，实验前预热至 65 。 A.2 聚丙烯 酰胺凝胶
16、电泳试剂 A.2.1 70 %乙醇 700 mL无水乙醇，加水定容至 1 L。 A.2.2 10TBE缓冲液 分别称取 108 g三羟基氨基甲烷， 55 g硼酸，加入 800 mL水加热溶解，再加入 0.5 molL-1 EDTA（ pH 8.0）溶液 37 mL，加水定容至 1 L。 A.2.3 1TBE缓冲液 100 mL 10TBE，加水定容至 1 L。 A.2.4 10 %APS 0.5 g APS溶于 5 mL水中。 A.2.5 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液（ 29:1） 分别称取 58 g丙烯酰胺， 2 g甲叉双丙烯酰胺， 100 mL 10TBE，加水定容至 1 L， 4 条件下保存
17、。 DB37/T 3801 2019 6 A.2.6 染色液 称取 1 g硝酸银，加水定容至 1 L。 A.2.7 显色液 6 g NaOH， 0.2 g四硼酸钠， 1.6 mL甲醛，加水定容至 400 mL。 DB37/T 3801 2019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 推荐引物 B.1 推荐引物见表 B.1。 表 B.1 推荐引物 序号 引物 连锁群 引物序列（ 53 ） 常见等位变异 bp 参照品种 8 GM1996 B03 F-catcccatcattttccctctt R-tacagtgaaggtgggatcctg 77 zh.h5034 77/92 zh.h2477 8
18、5 zh.h5327 87 zh.h1395 89 zh.h2764 92 zh.h2405 9 GM2638 A04 F-atgctctcagttcttgcctga R-cagacataacagtcagtttcacc 45 zh.h1689 55 zh.h2702 57 zh.h2384 63 zh.h4749 65 zh.h5327 69 zh.h2250 69/73 zh.h1843 73 zh.h0949 10 GNB317 未定位 F-gaaaagcttgcaaaatcgaga R-tccttccatgttggtgaatg 188 zh.h2550 194 zh.h0540 197
19、zh.h2561 200 zh.h2405 203 zh.h2764 212 zh.h5034 224 zh.h2462 227 zh.h0537 230 zh.h4749 11 GNB357 未定位 F-aggtttgctttgggatgatg R-ccgataaaaccaggcaagaa 191 zh.h5034 191/203 zh.h0436 194 zh.h1602 197 zh.h2406 203 zh.h0537 215 zh.h0861 218 zh.h1331 DB37/T 3801 2019 8 表 B.1 推荐引物（续） 序号 引物 连锁群 引物序列（ 5 3 ） 常见等
20、位变异 bp 参照品种 12 GNB556 A01 F-tcagggtgggttaccaacat R-taatccacattgaaccgacg 56 zh.h0525 56/71 zh.h5327 62 zh.h0934 68 zh.h2413 71 zh.h2410 77 zh.h0868 80 zh.h2231 86 zh.h1331 13 PM308 未定位 F-ccttcttctttctcctcctca R-caattcgtgatagtattttattggaca 64 zh.h5034 74 zh.h4749 78 zh.h0977 80 zh.h2764 82 zh.h2464 86
21、 zh.h2405 92 zh.h0680 14 pPGPseq2C11 A03 F-tgacctcaattttggggaag R-gccactattcatcgcggta 385 zh.h2456 403 zh.h2764 418 zh.h4749 439 zh.h2405 450 zh.h2406 461 zh.h0436 15 pPGSseq19D6 B05 F-tttgttatgctcacacccca R-aaaaatgaagcaatattttgttgttag 180 zh.h4779 180/192 zh.h5327 192 zh.h2406 192/204 zh.h2152 200
22、zh.h2508 204 zh.h0537 210 zh.h5034 DB37/T 3801 2019 9 C C 附 录 C （资料性附录） 参照品种名单 C.1 参照品种名单见表 C.1 表 C.1 参照品种名单 序号 种质库统一编号 品种名称 序号 种质库统一编号 品种名称 1 zh.h0099 赣榆小站秧 38 zh.h2292 浒山半旱种 2 zh.h0102 启东赤豆花生 39 zh.h2330 全州凤凰花生 3 zh.h0125 涡阳站秧 40 zh.h2384 英德白沙鸡豆仔 4 zh.h0436 蒲庙花生 41 zh.h2405 试花 1号 5 zh.h0477 睦屋拔豆 4
23、2 zh.h2406 试花 3号 6 zh.h0525 锦交 1号 43 zh.h2410 博山站秧子 7 zh.h0531 滕县滕子花生 44 zh.h2413 沂南小麻叶 8 zh.h0537 巨野小花生 45 zh.h2425 嘉祥长秧 9 zh.h0540 栖霞爬蔓小花生 46 zh.h2426 沂南大铺秧 10 zh.h0678 托克逊小花生 47 zh.h2456 郑 72-5 11 zh.h0680 北京大粒墩 48 zh.h2461 长垣一把抓 12 zh.h0764 昆嵛大粒墩 49 zh.h2462 濮阳 837 13 zh.h0861 反修 1号 50 zh.h2464
24、濮阳二糙 14 zh.h0868 栖霞半糠皮 51 zh.h2466 王屋花生 15 zh.h0930 莱芜蔓 52 zh.h2477 开封大拖秧 16 zh.h0934 夏津小二秧 53 zh.h2499 南江大花生 17 zh.h0949 牟平大粒蔓 54 zh.h2508 南溪二郎子 18 zh.h0977 汶上蔓生 55 zh.h2550 霸王鞭 19 zh.h1315 发财生 56 zh.h2561 潜山大果 20 zh.h1331 柳 城筛豆 57 zh.h2562 宿松土花生 21 zh.h1377 北镇大花生 58 zh.h2591 邵东中扯子 22 zh.h1395 花 33
25、 59 zh.h2608 大埔种 23 zh.h1585 洪洞花生 60 zh.h2682 岑巩藤花生 24 zh.h1602 辽中四粒红 61 zh.h2702 锦交四号 25 zh.h1672 临县花生 62 zh.h2764 早熟红粒 26 zh.h1689 青川小花生 63 zh.h4673 秭归磨坪红皮花生 27 zh.h1797 鄂花 5号 64 zh.h4749 赣花 2326 28 zh.h1816 金寨蔓生 -80选 65 zh.h4779 汕油 523 29 zh.h1843 茶陵打子 66 zh.h4923 桑植 C 30 zh.h1961 狮油红 4号 67 zh.h5
26、030 小河大花生 DB37/T 3801 2019 10 表 C.1 参照品种名单（续） 序号 种质库统一编号 品种名称 序号 种质库统一编号 品种名称 31 zh.h2069 狮头企 68 zh.h5034 沙洋 3527 32 zh.h2076 西农 3号 69 zh.h5060 岳西大花生 33 zh.h2152 惠水花生 70 zh.h5075 檀头六月籽 34 zh.h2177 永宁小花生 71 zh.h5098 三号仔 35 zh.h2208 沂南四粒糙 72 zh.h5327 群育 161 36 zh.h2231 大伏抚罗 1号 73 zh.h5365 经花 14号 37 zh.h2250 抚沟罗油 6号 74 zh.h5399 经花 48号 _
