1、ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 18222019 水禽圆环病毒感染 PCR 鉴别诊断技术 PCR diagnostic techniques for differentiating circovirus infection in waterfowls 2019 - 04 - 18 发布 2019 - 07 - 18 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 1822 2019 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 疫病简述 . . 1 3 PCR 鉴别诊断. . 1 附录 A（规范 性附录） 相关试剂的配制 . 4 附录 B（资
2、料 性附录） 参考序列 . 6 附录 C（资料性附录） PC R 检测结果 电泳图例 . . 7 DB35/T 1822 2019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心、江西省萍乡市科学技术 情报研究所、宁德海关检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：傅光华、施少华、黄勇、彭春香、傅秋玲、黄瑜、白泉阳、叶洪、万春和、 程龙飞、陈红梅、刘荣昌、陈珍、陈翠腾、朱春华、吴波平、庄晓东。 DB35/T 1822 2019 1 水禽圆环病毒感染 PC
3、R 鉴别诊断技术 1 范围 本标准规定了水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断的操作技术要求。 本标准适用于鸭圆环病毒、鹅圆环病毒感染的鉴别诊断。 2 疫病简述 水禽圆环病毒（Waterfowl circovirus）为圆环病毒科圆环病毒属的成员，主要包括鸭圆环病毒 （Duck circovi rus,DuCV）和鹅圆环病毒（Goo se circovirus,GoCV），基因组均为环状单股正链 DNA。 DuCV可感染不同品种、日龄的鸭，GoCV可感染不同品种、不同日龄的鹅。水禽圆环病毒主要侵害水 禽免疫系统，导致宿主免疫应答机能下降，临床上造成被感染动物生长迟缓，并易引起其他细菌和病毒 的继发或混
4、合感染。 3 PCR 鉴别诊断 3.1 仪器设备 3.1.1 PCR 仪。 3.1.2 台式冷冻离心机（转速不低于 12 000 r/min）。 3.1.3 微量移液器。 3.1.4 组织匀浆器。 3.1.5 电泳仪。 3.1.6 电泳槽。 3.1.7 紫外凝胶成像系统。 3.2 试剂 3.2.1 蛋白酶 K。 3.2.2 10%十二烷基苯磺酸钠（SDS）：配制方法见附录 A 的 A.1。 3.2.3 Tris 饱和苯酚。 3.2.4 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。 3.2.5 3 mol/L 的醋酸钠溶液：配制方法见附录 A 的 A.2。 3.2.6 无水乙醇。 3.2.7 75%乙醇
5、：配制方法见附录 A 的 A.3。 3.2.8 溴化乙锭溶液：配制方法见附录 A 的 A.4。 3.2.9 1TAE 缓冲液：配制方法见附录 A 的 A.5。 3.2.10 1.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A 的 A.6。 3.2.11 DNA 相对分子质量标准物：100 bp ladder。 3.2.12 10加样缓冲液：配制方法见附录 A 的 A.7。 DB35/T 1822 2019 2 3.3 样品的采集与处理 样品的采集与处理依照国家采样标准执行，具体如下：无菌采集生长不良、羽毛紊乱、体况消瘦或 发病鸭（鹅）的法氏囊、脾脏等器官，剪碎后与磷酸盐缓 冲液（PBS，见附录A的A.8）
6、按体积比1：5的 比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8 000 r/min 离心30 min，取上清，用于DNA抽提，或置-20 冻 存备用。 若采集的样品需放置6 h以上再进行处理，应先置 -20 条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或 冰冻状态运输。 3.4 引物设计 根据水禽（鸭、鹅）圆环病毒两个主要蛋白基因3 之间的间隔序列差异设计3条特异性引物： CVF：5 - AAY CWC GCG GGA AGT GGT GGG A -3； DuCVR：5 - TTC TAR GCA TAA ACG AGA TC -3； GoCVR：5 - ATA MGA TTC GGA CAA TGG ACT
7、G -3。 其中，CVF为共用上游引物，CVF与DuCVR用于检测DuCV，扩增条带为554 bp大小的基因片段，CVF 与GoCVR用于检测GoCV，扩增条带为407 bp大小的基因片段。各引物的工作浓度均为 10 mmol/L，保存 于4 8 条件下。 3.5 样品中病毒 DNA 提取 3.5.1 常规 DNA 提取步骤： 3.5.1.1 取 540 L 匀浆液上清，加入 60 L 10%的 SDS，加入蛋白酶 K 至终浓度 5 mg/mL，充分混 匀 15 s，56 水浴 2 h。 3.5.1.2 加入等体积 Tris 饱和苯酚，充分混匀 15 s，在 4 条件下 12 000 r/mi
8、n 离心 15 min。 3.5.1.3 吸取离心后各管中的上清液转移至灭菌管(注意不要吸出中间层)， 加入与上清液等体积的酚/ 氯仿/异戊醇混合物（混合物中三者比例依次为 25:24:1），颠倒混匀 15 s，静置 5 min 后，在 4 条 件下 12 000 r/min 离心 15 min。 3.5.1.4 重复 3.5.1.3 步骤 1 次。 3.5.1.5 吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中，加入 1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠溶液（pH 值为 5.2）、2.5 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀 15 s，-20 沉淀 2 h。 3.5.1.6 于 4 条件下，13 00
9、0 r/min 离心 15 min。轻轻倾去上清液，加入 800 L 75%乙醇清洗 沉淀 2 次，2 000 r/min 离心 15 s，用无菌枪头吸尽残余液体，室温静置 5 min。 3.5.1.7 加入 50 L 灭菌去离子水重悬，轻轻混匀溶解管壁上的 DNA，冰上保存备用。提取的 DNA 应 在 2 h 内进行 PCR 扩增或保存于-20 冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。 3.5.2 商品化试剂盒 DNA 提取方法 也可采用市售商品化的DNA提取试剂盒，完成样品中病毒DNA的提取。 3.6 对照 分别以鸭圆环病毒、鹅圆环病毒DNA样品作为阳性对照。以番鸭细小病毒或其他病毒（如鸭瘟病
10、毒、 产蛋综合征病毒等）DNA样品作为阴性对照。以上对照样品均由指定单位提供。 3.7 PCR 反应 3.7.1 常规 PCR 反应操作 DB35/T 1822 2019 3 3.7.1.1 PCR 反应液配置为：每个反应管的 PCR 反应体系为 25 L，依次加入 17.75 L 灭菌去离子 水，2.5 L Taq 聚合酶 10缓冲液，0.5 L dNTP s （2.5 mmo l/L each），0.5 L Taq DNA 聚合 酶（1 U/L），引物 CVF 0.75 L（10 mmol/L），引物 DuCVR 和 GoCVR 各 0. 5 L（10 mmol /L）， 样品 DNA 2
11、 L，0.5 L MgSO 4（50 mmol/L）。 3.7.1.2 PCR 反应步骤：混匀后 2 000 r/min 离心 15 s，使反应混合液都沉降到 PCR 管底。将上述混 合物按照以下步骤进行 PCR：95 预热 5 min 后，按以下循环参数循环：94 、30 s，53 、30 s， 72 、1 min，循环 35 次；72 延伸 8 min，反应结束后保存于 10 。 3.7.2 商品化试剂盒 PCR 反应操作 也可采用市售商品化的常规PCR试剂盒，并按试剂盒的操作说明完成。 3.8 PCR 产物电泳 反应结束后，分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5 L
12、 PCR产物 与0.5 L 10加样缓冲液混合均匀， 加入到1.0%琼脂糖凝胶板的样孔中， 同时在另一样孔中加5 L DNA 作为标准分子量对照；以5 V/cm的电场强度进行电泳，30 min后经紫外凝胶成像系统观察结果。 3.9 测序 使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现407 bp或554 bp大小的 扩增条带，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，鹅圆环病毒参考序列参见附录B 的B.1，鸭圆环病毒参考序列参见附录B的B.2。 3.10 结果判定 3.10.1 实验成立条件 当阳性对照样品中，鹅圆环病毒样品出现407 bp大小的扩增条带（参见
13、附录C中图C.1的2号泳道）， 鸭圆环病毒样品出现 554 bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的3号泳道），阳性样品混合物出现 407 bp和554 bp大小的扩增条带（参见附录C 中图C.1的4号泳道），空白对照样品和阴性对照样品均无 特异性扩增条带（参见附录C中图C.1的1号、5号泳道），本次实验结果有效。 3.10.2 待检样品结果判定 3.10.2.1 当待检样品出现 407 bp 左右特异性条带（参见附录 C 中图 C.1 的 8 号泳道），所获扩增产 物与参考序列（参见附录 B 的 B.1）或 GenBank 数据库中水禽圆环病毒基因序列同源性达到 90%以上， 可判样品为
14、GoCV 核酸阳性； 3.10.2.2 当待检样品出现 554 bp 左右特异性条带（参见附录 C 中图 C.1 的 6、7 号泳道），所获扩增 产物与参考序列（参见附录 B 的 B.2）或 GenBank 数据库中水禽圆环病毒基因序列同源性达到 80%以上， 可判样品为 DuCV 核酸阳性； 3.10.2.3 无特异性扩增条带（参见附录 C 中图 C.1 的 9 号泳道）判样品为水禽圆环病毒核酸阴性。 DB35/T 1822 2019 4 A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 10%十二烷基苯磺酸钠（SDS） 称取高纯度的SDS 100 g置于1 000 m L烧杯中，加入
15、蒸馏水800 mL，68 加热溶解，温度降至室温 后滴加浓盐酸调节pH值至7.2，再定容至1 000 mL，室温保存备用。 A.2 3 mol/L的醋酸钠溶液(NaOAc) 称取40.8 g NaOAc 3H2O置于200 mL烧杯中，加入蒸馏水40 mL搅拌溶解，用冰醋酸调剂pH值至5.2， 加蒸馏水定容至100 mL，1.034 10 5 Pa高压灭菌30 min，常温保存备用。 A.3 75%乙醇 取无水乙醇750 mL加入蒸馏水250 mL ，定容至1 000 mL，-20 保存备用。 A.4 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 20 mg 蒸馏水 至20 mL A.5 1TAE电泳缓冲液
16、 A.5.1 配制0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 称取二水乙二铵四乙酸二钠18.61 g溶解于适量灭菌去离子水中，混匀后用10%氢氧化钠溶液调pH 值为8.0，最后用蒸馏水至100 mL。 A.5.2 配制50 TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8 .0） 100 mL 蒸馏水 至1 000 mL 用蒸馏水稀释50倍使用。 A.5.3 配制1 TAE电泳缓冲液 50TAE电泳缓冲液 20 mL 蒸馏水 至1 000 mL DB35/T 1822 2019 5 A.6
17、 1.0%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1TAE电泳缓冲液 至100 mL 置微波炉中加热至完全融化，待冷至50 60 时，加溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀后倒入制 胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。 A.7 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 蒸馏水 至100 mL A.8 0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 将上述试剂溶于800 mL蒸馏水中，定容至1 000 mL，1.03410 5 Pa高压灭菌30 min，4 保存备 用。 说明：上
18、述试剂若有更环保、更安全、操作便捷的正规商品化的试剂可等效使用。 B DB35/T 1822 2019 6 B C 附 录 B （资料性附录） 参考序列 B.1 PCR扩增的鹅圆环病毒基因序列（共 407 bp） AATCTCGCGGGAAGTGGTGGGATGGCTATAATGGGCAGGATGTGGTTGTGATGGATGATTTTTATGGGTGGCTCCCTTACGATGA CCTTTTAAGGATCTGTGATCGCTATCCTTTACGGGTTGAGTATAAGGGTGGTATGACCCAGTTCGTGTCTAAGACCCTTATAATTACTT CTAATAGGGAGCCTCGC
19、GATTGGTATAAATGCGAGTGTGATGTGTCGGCATTGTATCGGAGAATTAATCAGTACCTGATATTAACCCCG GATGGTTATGCGCCCGCCCCTGATTTTATGCTGCCGTTCCCAATAAACTACTAGAGACCTGGTTAAGGTTAGAATAAGGATCGTTTATT GTGTAAAATTACAATAAAGTTATGGTGCAAGCCCAGTCCATTGTCCGAATCTTAT B.2 PCR扩增的鸭圆环病毒基因序列（共 554 bp） AACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTACTCGGGAAATGACGTAGTCGTCA
20、TGGACGACTTTTATGGTTGGTTGCCTTATGATGA TTTGCTGAGAATTACCGACCGTTACCCTTTACGGGTTGAATTTAAAGGCGGTATGACTCAGTTTGTGGCTAAGACCTTGATCATAACAA GTAACCGCGAGCCTCGTGATTGGTACAAGAGCGAGTTTGACCTTTCAGCTCTGTACCGCAGAATTAACAAGTATCTTGTGTATAACATT GACAAGTACGAACCCGCCCAGGCATGTACCCTCCCGTTCCCAATAAACTACTGAGACCAATTTGCCGTGAGTCGTTTATTAAGGT
21、AAAC ACTTGGCAGGGTATTACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGCACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGC ACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGCACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGA ACAAGATCTCGTTTATGCTTAGAA DB35/T 1822 2019 7 C D 附 录 C （资料性附录） PCR 检测结果电泳图例 PCR检测结果电泳图见图C.1。 说明： M DNA相对分子质量标准物； 1 空白对照样品扩增结果； 2 GoCV阳性样品扩增结果； 3 DuCV阳性样品扩增结果； 4 GoCV和DuCV阳性样品混合物扩增结果； 5 阴性样品扩增结果； 6、7待检样品DuCV阳性扩增结果； 8 待检样品GoCV阳性扩增结果； 9 待检样品阴性扩增结果。 图C.1 PCR 检测结果电泳图 _ DB35/T 18222019 福建省地方标准 水禽圆环病毒感染 PCR 鉴别诊断技术 DB35/T 1822 2019 * 2019 年 4 月第一版 2019 年 4 月第一次印刷
