1、ICS 65.020.01 B 15 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3074 2018 风沙半干旱区玉米 /花生防蚀增效 花生抗网斑病鉴定技术规程 Rule for evaluation of resistance to web blotch in peanut 2018 - 12 - 25 发布 2019 - 01 - 25 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3074 2018 1 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省 农村经济委员会 提出 并 归口。 本标准由辽宁省农业科学院负责 起草 。 本标准主要起草人：臧超群、
2、林英、谢瑾卉、于舒怡、梁春浩、刘晓舟 、 安福涛 、 张海东 、 金桂华 。 DB21/T 3074 2018 2 花生 抗网斑病鉴定技术 规程 1 范围 本 标准 规定了 花生抗网斑病 （ Phoma arachidicola Marasas Pauer & Boerema） 鉴定技术的病原物分 离 、 接种体制备、室内抗性鉴定、田间抗性鉴定、病情调查、 抗性 评价、鉴定记载 方法 等 。 本标准适用于花生 （ Arachis hypogaea L.） 品种及种质资源对花生网斑病抗性的室内、田间鉴定及 评价。 2 规范性引用文件 下 列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅
3、所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2391 农作物品种区域试验与鉴定规程 花生 GB/T 6682 分析 实验室用水规格和试验方法 3 试剂 、 材料 与仪器 设备 本 标准所用试剂在未加说明时 均 采用分析纯试剂。 实验室 用水应符合 GB/T 6682中 规定的三级水要 求。 3.1 PDA 培养基 称取 200g 马铃薯 ，洗净去皮切碎，加入 1000mL 水 ，煮沸 20 min 30min， 纱布过滤，补水至 1000mL， 再加入 18g 琼脂 和 18g 葡萄 糖，搅拌均匀，高压灭菌（ 121， 20mi
4、n） 。 3.2 OA 培养基 称取 燕麦粉 15g， 加入 水 1000mL，煮沸 30min， 加入 琼脂 10g， pH 自然 ，高压灭菌（ 121， 20min）。 3.3 恒温培养箱 ：（ 28+2） 。 3.4 显微镜： 物镜头 10 倍 -100 倍。 3.5 电子 天平：感量 0.01g。 3.6 超净工作台 。 DB21/T 3074 2018 3 3.7 高压灭菌器 。 3.8 冷藏 箱 （ -4 ） 。 3.9 低温冰箱： 最低温度 -40 4 病原物分离 与 接种体制备 4.1 病原物分离 从 具有 典型症状的 花生叶片病斑处挑取花生网斑病菌分生孢子器置于 无菌水中 震
5、荡 3min， 将分生孢 子悬浮液 涂布 于水琼脂 平板上，用接种针挑取 单 孢置于 马铃薯 葡萄糖 （ PDA）培养 基 上， 26 培养箱 中 暗 培养 ，经观察 菌落 和 孢子形态结合 ITS序列 比对，鉴定为 花生茎点霉 菌 (P. arachidicola Marasas. Pauer & Boerema)， 致病性测定 后确定为供接种用菌株 。 于 4 条件 下保存 ， 或 20%甘油中 -40 条件 下 长期保存 ，备 用。 4.2 接种体制备 接种前 15d30d，将病菌接种于马铃薯 葡萄糖（ PDA） 培养 基 平板上 25 恒温培养 5d，利用 5mm 打 孔器从菌落边缘制
6、 取 菌饼，置于燕麦 琼脂 （ OA） 培养基平板上 25 、近紫外 灯照射（波长 340380nm， 8W 3）培养 10d20d。用无菌解剖刀于超净工作台中刮取病菌 的 分生孢子器，置于装有少量无菌水的 50mL 无菌烧杯中，静置 20min，使分生孢子器吸水胀破，释放分生孢子， 配制 成浓度为 1 105个 /mL 孢 子悬浮液（ 如未立即接种使用，可置 4 条件 下 保存，保存时间 3d 以内）。接种前 每 毫升 孢子悬浮液中 加入 Tween201 L 以增加病菌孢子与叶片的粘附性，加入 0.05mg 蔗糖提高孢子萌发率。 5 室内抗性 鉴定 5.1 室内离体 叶片准备 在长宽高为
7、10cm 10cm 8cm的 花盆中 播种籽粒饱满 的花生 种子 3粒，定期 浇水， 于每天 26 、 12h 光暗 交替的培养箱中 培养至下针 期。 剪取 底部 向上 的第 3、 4片 复叶， 用脱脂棉 包裹叶柄 插入经人工 打孔 后 的接种杯 （直径 4cm，高 4.8cm）中 ， 杯内 放入 30mL清水。 5.2 接种 用 8号水粉笔沾取孢子悬浮液均匀涂抹于离体叶片，直至整片复叶涂满孢子悬浮液，用 6号自封袋 （ 120mm 170mm）保湿。 5.3 接种后 管理 DB21/T 3074 2018 4 将 接种后的离 体叶片放置于 每天 26 、 12h光暗 交替的 植物 培养 箱中
8、 培养。 5.4 病情 调查 接种后 25d30d，进行病 情 调查，同批次的材料应在 24h内完成。 5.5 调查方法 目测每份鉴定 材料发病状况，根据病害症状描述，调查记载病情级别。 5.6 病情分级 病情分级及其对应的症状描述见表 1。 表 1 花生品种抗网斑病鉴定病情级别划分标准 病情级别 病害症状描述 0 整片复叶无病症状； 1 病斑面积 10%； 3 10%病斑面积 25%； 5 25%病斑面积 50%； 7 50病斑面积 75%； 9 75%病斑面积。 6 田间抗性鉴定 6.1 抗性鉴定圃设置 抗性鉴定圃设置在具备良好的自然发病环境条件、灌溉良好、地势平坦、地力均匀的地块。 6.
9、2 小区设计 鉴定材料随机排列。小区行长 5m， 4行区，行距 0.5m或 0.6m，小区保苗 80穴左右。 每 20份鉴定材料 各 设 1组 抗、感病 对照 ，抗病对照品种为鲁花 11，感病对照品种为四粒 红 。 6.3 种植要求 鉴定材料播种时间 、 栽培管理 与大田生产相同 ， 整个生长季 不施用 杀菌剂 。 6.4 接种 6.4.1 接种期 接种期为花针期 。 6.4.2 接种方法 DB21/T 3074 2018 5 每个品种随机 连续 选择 10 株，用 8 号水粉笔沾取孢子悬浮液均匀涂布主茎中下部 4 片复叶，用 6 号自封袋（ 120mm170mm ）保湿。 6.5 接种后管理
10、 在接种期如遇干旱天气，应及时进行田间浇灌，确保病害发生。 6.6 病情调查 接种后 15d20d，进行病情 调查， 同批次的材料应在 1d2d 内完成。 6.7 调查方法 同 5.5 6.8 病情分级 同 5.6 7 抗性评价 7.1 鉴定有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（ 9 级），该批次材料抗网斑病鉴定视为有效。 7.2 抗性评价标准 依据鉴定材料发病程度（病情级别） 确定其抗性水平 ， 划分标准见表 2。 表 2 花生 抗 网斑病评价标准 病情级别 抗性 评价 0 免疫（ IM） 1 高抗（ HR） 3 抗 （ R） 5 中抗（ MR） 7 感 （ S） 9 高感（ HS）
11、 7.3 重复鉴定 初次鉴定时表现为 免疫、 高抗 和 抗 病的花生品种 应在次 年进行重复鉴定。 7.4 抗性评价 DB21/T 3074 2018 6 对初次鉴定结果和重复鉴定结果进行比较，以记载的最高病情级别为最终鉴定结果，并依此结果对 鉴定材料进行抗性评价 8 鉴定记载表格 花生抗网斑病鉴定结果记载见表 3。 表 3 年 花生抗网斑病 鉴定结果记载表 编 号 品种名称 病情级别 抗性评价 注 1: 鉴定地点 注 2: 接种病原菌分离物编号 注 3: 接种日期 调查日期 鉴定技术负 责人（签字） ： DB21/T 3074 2018 7 附录 A （资料 性附录） 花生网斑病菌 A.1
12、学名和形态描述 A.1.1 学名 花生网斑病致病菌为花生茎点霉 (Phoma arachidicola Marasas Pauer & Boerema)，半知菌门 （ Deuteromycotina），腔孢纲 (CoeZomycetes），球壳孢目（ Sphacropsidales），茎点霉属（ Phoma）。 A.1.2 形态描述 花生网斑病菌丝体在燕麦 琼脂培养基 （ OA） 上菌落呈白色至灰白色，圆形 ，粘性 较差 ，菌丝体白 色 透明，有隔，分生孢子器褐 色，圆形或不规则形，有孔口，其大小为 175.5m 96.85m。 分生孢子椭 圆形 ， 无色单孢 ， 通常中间有隔膜 ， 顶端有油
13、球 ， 其大小为 5.89m 3.41m。厚垣孢子单生或串生， 外壁和两孢子夹壁变厚，暗褐色，类球形或不规则形，单孢被 1个或几个横隔分开，分隔处缢缩 9-12m 8-17m。 A.1.3 病菌 图片 茎点霉 分生孢子 器 及分生孢子 花生网斑病菌菌落形态 DB21/T 3074 2018 8 附录 B (资料 性附录 ) 花生网斑病症状 B.1 病名和症状 描述 B.1.1 病名 花生网斑病 peanut web blotch B.1.2 症状描述 花生网斑 病 是花生 生产上一种常见的 真菌病害 ,主要为害 叶片， 也可为害茎和叶柄 ，其症状随发病 条件的不同有所差异。病斑先出现在植株基部的叶片上，侵染初期菌丝体以菌索状于叶片表面蜡质层下， 呈白网状，随后从侵染点沿叶脉以放射方式向外扩展，呈星芒状粉点，随病斑扩大，由白、灰白、褐至 黑褐色，形成边缘不清网状斑。当湿度大、温度高时，便出现直 径 11.5cm 的大块斑点。病斑部背部初 期和中期不表现症状，后期出现褐色斑痕，表皮下有黑色小突起 。 生 产上该病常与褐斑病、黑斑病混合 发生，造成严重落叶。 B.1.3 症状图片 花生网斑病田间症状 _
