1、 ICS 65.020.01 B 16 备案号： 60274-2019 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1491 2018 油菜籽 (种子 )中细菌性黑斑病菌检测方法 Detection methods for Pseudomonas syringae pv. maculicola in Rapeseed(Seeds) 2018-09-30 发布 2018-12-30 实施 内蒙古自治区质量技术监督局 发布 DB15/T 1491 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草 。 本标准由二 连浩特出入境检验检疫局技术中心提出 。
2、本标准由内蒙古自治区质量技术监督局归口 。 本标准起草单位：中华人民共和国二连浩特出入境检验检疫局技术中心、中华人民共和国南海出入 境检验检疫局技术中心、中华人民共和国满洲里出入境检验检疫局技术中心 。 本标准主要起草人：袁淑珍、张永宏、张志峰、李凯兵、刘玮琦、魏宇虹、李菁雯 。 DB15/T 1491 2018 1 油菜籽 (种子 )中细菌性黑斑病菌检测方法 1 范围 本标准规定了油菜籽 (种子 )中细菌性黑斑病菌的鉴定、检测结果判定等要求 。 本标准适用于油菜籽 (种子 )中细菌性黑斑病菌的检测方法 。 2 规范性引用文件 下列文件 对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所
3、注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 细菌性黑斑病菌 Bacterial black spot 学名 : Pseudomonas syringae pv Maculicola，简称 PSM。 中文名 :丁香假单胞杆菌斑生致病变种 。 该病菌属于原核生物界 Procaryotae，薄壁菌门 Gracilicutes，假单 胞菌科 Pseudomonadaceae。 4 病菌的鉴定 4.1 PCR 初筛 4.1.1 样品 DNA 提
4、取 从油菜籽 (种子 )样品中取 200 g用作检测样品。在样品中加入 350 mL生理盐水， 4 浸泡过夜；纱 布过滤，滤液 10000 r/min离心 15 min， 1 mL灭菌水悬浮沉淀，转入 EP管 12 000 r/min离心 5 min，沉淀 用于提取 DNA。用细菌 DNA提取试剂盒提取 DNA。重复 3次 。 4.1.2 PCR 检测 分别取 2 L样品 DNA，检测 hrpZ基因和冠毒素基因，分别进行 PCR扩增。用十字花科黑斑病菌标准 菌株 DNA作阳性对照，用灭菌 蒸馏水作空白对照 。 hrpZ基因检测引物 MM5F(5-gaacgagctgaaggaagaca-3)/
5、5R(5-cagcctggttagtctggtta-3)，预期扩增产物 532 bp；冠毒素基因检测引物 cfl F(5-ggcgctccctcgcactt-3)/R(5-ggtattggcgggggtgc-3)，预期扩增产物 670 bp。 PCR反应体系 ： PCR反应总体积为 30 L， 包含： 10 mmol/L Tris-HCl； 50 mmol/L KCl（ pH 8.3）； 1.5 mmol/L MgCl2； dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP浓度均为 100 mol/L；引物浓度各为 100 nmol/L；模板 DB15/T 1491 2018 2 DNA为 2 L；
6、 1.5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为： 94 3 min； 94 30 s， 57 （引物 cfl F/R为 67 ） 30 s， 72 45 s，循环 35次；最后 57 5 min。 4.1.3 电泳分析 扩增产物电泳， EB染色后用凝胶成像系统分析 。 取 10 L扩增产物与 3 L 6上样缓冲液混合均匀，在 1.5 %琼脂糖凝胶 1 TAE缓冲液中 (4 V-6 V/cm)电泳 30 min，核酸染料染色后凝胶成像系统分析。如果 PCR初筛结果 2对引物扩增均为阳性，需继 续以下验证 。 4.2 分离培养 4.2.1 菌悬液制备 如油菜籽 (种子 )样品 PCR初检为阳性，另
7、取样品 50 g，加入 100 mL 生理盐水， 4 浸泡过夜；纱布 过滤，滤液 10000 r/min离心 20 min， 1 mL灭菌水悬浮沉淀，沉淀悬浮液 10倍系列稀释备用 。 4.2.2 病原菌分离 分别取稀释 10倍、 100倍和 1000倍菌悬液各 100 L涂布 MT培养基平板，每个稀释度 10次重复。 MT 平板置于 26 培养箱内培养 3 d 4 d，挑取疑似菌落在 KB培养基上纯化三次用于后续检测 。 4.3 菌落特征鉴 定 油菜籽 (种子 )提取液在 MT培养基上培养 3 d后， PSM的典型菌落特征为乳白色，圆形至椭圆形，表面 干扁；菌落周围无透明水解圈。培养 4 d
8、 7 d后，菌落周围出现小而模糊的水解圈。 4.4 PCR 检测和产物序列分析 对疑似菌落在 KB培养基上纯化后，无菌水洗脱，取菌液 1 mL， 12000 r/min离心 5 min，收集菌体， 用细菌 DNA提取试剂盒提取 DNA。按照 4.1.2中的方法进行 PCR 检测。扩增产物约为 307 bp，测序结果与 GenBank中 PSM菌株和相关菌株做序列相似性比对分析 。 4.5 致病性测试 选取与 PSM菌落形态特征相符且 PCR检测阳性的分离物，用无菌水配成 108 CFU mL的菌悬液，无菌 棉签蘸取菌悬液均匀涂布接种四周龄健康油菜幼苗嫩叶，以无菌水作为对照，幼苗接种后保湿 24
9、 h，之 后转入 20 光照培养箱内培养， 7 d后观察发病情况，对接种发病幼苗叶片进行病原菌的再分离、纯化， 并与最初的接种物进 行比较。 5 结果判定 分离物培养后，根据菌落形态特征、 PCR检测结果、序列分析的结果，进行结果判定。若 4.1PCR初 筛和 4.4病菌的分离物 PCR检测为阳性，且形态特征符合 4.3中描述，可判定为十字花科黑斑病菌 Pseudomonas syringae pv. maculicola。 DB15/T 1491 2018 3 A A 附 录 A （资料性附录） 主要试剂和仪器设备 A.1 主要试剂 蒸馏水、 0.5 %次氯酸钠 ； 除另有规定外，所有试剂均
10、为分析纯或生化试剂，实验用水应符合 GB/T 6682的规定 ； PBS 缓冲液 : NaCl 8. 10 g、 NaH2PO4 0. 18 g、 Na2HPO4 1. 97 g、蒸馏水 1000 mL， pH 7. 4； 细菌基因组 DNA提取试剂盒 ； PCR试剂：商用 PCR试剂，包括 PCR buffer， dNTP， Taq酶； 凝胶电泳试剂：包括琼脂糖， TAE Buffer， Loading Buffer， EB。 A.2 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、核酸测定仪、 PCR仪、凝 胶成像系统、电泳仪、培养箱和植物生长箱、超低温冰箱、常规
11、冰箱、旋涡振荡器 。 DB15/T 1491 2018 4 B B 附 录 B （资料性附录） 培养基 B.1 MT（ Milk TweenMT）培养基 胰蛋白胨 10g、无水氯化钙 0.25g、酪氨酸 0.5g、琼脂粉 15g、脱脂奶粉 10g、制霉素 40mg、头孢氨苄 80mg、盐酸万古霉素 10mg、无菌吐温 -80 10mL和灭菌水 1000 mL； B.2 KB(King S medium B)培养基 H2O 1000 ml、蛋白胨 20.0 g、甘油 10.0 ml、 K2HPO4 1.5 g、 MgSO4.7H2O 1.5 g、琼脂 15.0 g、 KOH 调 PH值 7.2；
12、 B.3 NA( Nutrient Agar）培养基 酵母粉 1 g、牛肉浸膏 3 g、蛋白胨 5 g、蔗糖 10 g、琼脂 17 g、水 1000 mL。 以上培养基均于 121 高压蒸气灭菌 20 min后保存于室温 。 DB15/T 1491 2018 5 C C 附 录 C （资料性附录） 十字花科细菌性黑斑病菌基本信息 C.1 病原菌 十字花科细菌性黑斑病是由丁香假单胞杆菌斑生致病变种 （ Pseudomonas syringae pv Maculicola， 简称 PSM） 引起的十字花科作物重要种传病害。该病菌短杆状，大小为 1.3 m 3.0 m0.7 m 0.9 m， 有 1
13、 5 根极生鞭毛，革兰氏染色为阴性。 C.2 寄主植物 寄主主要是十字花科植物，如白菜 Brassica pekinensis Rupr.、 花椰菜 Brassica oleracea L. var. botrytis L.、萝卜 Raphanus sativus L.等，同时也可危害辣椒 Capsicum annuum L.、番茄 Lycopersicon esculentum Mill. 。 1911年 McCulloch首次报道该病菌在花椰菜上，随后在芥菜 Brassica juncea (L.) Czern. et Coss.、 芜菁 Brassica rapa var. rapa、油
14、菜 Brassica napus L.等超过 25种十字花科植物上陆续发现了该病菌的危 害 。 C.3 分布 该病菌广泛分布于世界各地。如美国、英国、法国、澳大利亚和阿根廷等国。 2002年，该病菌引起 的萝卜细菌性黑斑病在我国湖北省长阳县高山蔬菜基地爆发流行，造成较大经济损失。 2007年该病菌被 列为中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录。目前，国内局限分布于浙江、湖北、湖南、云 南和广东等省 。 C.4 传播途径 病菌主要在种子上或土壤及病残体上越冬，在土壤中可存活 1年以上， 主要在莲座期至结球期侵染。 病菌可通过灌溉水、雨水或昆虫带菌侵染。 C.5 病原形态及生物学特征 在肉汁胨琼
15、脂平面上菌落平滑有光泽， 白色至灰白色，边缘为光滑圆形，质地均匀，后具皱褶。 在 KB培养基上产生蓝绿色的荧光。该菌在 0 32 均可生长，以 24 25 最适，致死温度 49 ，适应 pH6.18.8，最适 pH为 7，对氨苄青霉素尤其敏感。十字花科黑斑病菌种子提取液在 MT培养基上培养 3d 后， PSM的典型菌落特征为菌落乳白色，圆形至椭圆形，表面干扁；菌落周围无透明水解圈。培养 4d 7d后，菌落周围出现小而模糊的吐温 80水解圈，与大而透明的酪蛋白水解圈差异明显。见图 C.1。 C.6 典型症状 DB15/T 1491 2018 6 该病菌主要危害十字花科蔬菜的叶、茎和荚。病菌感染叶
16、片时先在叶片上形成 1 mm大小的水浸状小 斑点，最初为暗绿色，扩展后呈 3mm4mm不规则形，淡褐色、边缘紫褐色病斑，斑点多发生在气孔处， 因受叶脉限制表现为角斑，病斑中间色深发亮具油光状，数个病斑常融合成不规则坏死大斑，严重的叶 脉变褐，叶片变黄脱落或扭曲变形，只剩叶梗和主叶脉，导致植株死亡；茎和荚染病，可产生深褐色不 规则条状斑。细菌性黑斑病的诊断要点：病斑初期呈水浸状 /水渍状；叶面病斑扩展受到叶脉限制 呈多角形的角斑；部分病斑表面有菌脓溢出；病部 的切片镜检可见明显的喷菌现象 。 C.7 致病性测试形态特征 以无菌水作为对照，十字花科细菌性黑斑病菌在健康油菜幼苗嫩叶上的接种症状，见图 C.2。 图 C.1 MT 培养基上的菌落形态 （引自叶露飞） 图 C.2 十字花科黑斑病菌在油菜上的接种症状 （引自叶露飞） A： 使用无菌水 ； B: 接种十字花科黑斑病菌 ATCC51320； C： 接种十字花科黑斑病菌 5309-1； D： 接种十字花科黑斑病菌 2305-1。 _
