1、ICS 11.020 C 62 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生 行 业 标 准 WS/T 571 2017 裂头绦虫幼虫检测 Detection of diphyllobothroid larvae 2017 - 08 - 01 发布 2018 - 02 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 WS/T 5712017 I 前 言 本标准 依据 GB/T 1.1 2009给出的规则 起草 。 本标准起草单位： 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 、上海出入境检验检疫局、上海市疾病预防控制中心 。 本标准起草人： 陈韶红、李树清 、张小萍、许学年、卢艳、蔡玉春、
2、张永年、李浩、艾琳、郑彬 。 WS/T 5712017 1 裂头绦虫幼虫检测 1 范围 本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程。 本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头 绦虫幼虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 裂头蚴 plerocercoid larva
3、e 裂头绦虫的幼虫，是假叶目（ Pseudophyllidea） 、 裂头科（ Diphyllobothriidae）绦虫 第三期幼虫的总 称 （ 参 见附录 A） 。 3.2 阔节裂头蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或 phyllobothrium latum 寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的 第三期 幼虫 。 3.3 曼氏裂头蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni 寄生在蛙 、蛇或人体内 曼氏迭宫绦虫的 第三期 幼虫 。 4 仪器器材 WS/T 5712017 2 4.1 生物显微镜
4、。 4.2 体视显微镜 。 4.3 PCR 扩增仪 。 4.4 电泳仪 。 4.5 凝胶成像系统。 4.6 超净工作台 。 4.7 高速离心机 。 4.8 解剖用手术器械。 5 试剂材料 5.1 试 剂 胃蛋白酶消化液； Tris-乙酸电泳缓冲液（ TAE）；琼脂糖凝胶； 6 加样缓冲液； 100 2000 bp DNA marker； 灭菌双蒸 馏 水 (ddH2O)； 70%乙醇（配制见附录 B 的 B.1） 。 5.2 引物 扩增裂头蚴核糖体 DNA 转录间隔区（ ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素 C 氧化酶（ Cox1）引物序列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（
5、 见附录 B 的 B.2）。 5.3 阳性对照 阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。 6 检测步骤 6.1 样品准备 6.1.1 样品种 类 ： 海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。 6.1.2 样品采集： 采样按照 GB/T 18088 执行。 6.2 样品检测 6.2.1 压片检查法 WS/T 5712017 3 用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条 /只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物的组织用载玻片压片， 用生物显微 镜 镜 检判定结果。 6.2.2 蛋白
6、酶消化法 称取样品 250 g 并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液 1:5 的比例加入消化液， 37消化至无肉眼可见的肉组织为止。消化后用 0.8mm 0.8mm（ 10 目）网筛过滤，滤 液置于尖底量筒内，加水（用水参照 GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿， 用体视 显微 镜 镜检判定结果。 6.2.3 核酸检测法 6.2.3.1 取样 在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。 PCR 反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。无菌水作空白对照。 6.2.3.2 DNA 的提取 （见 附录 B 的 B.3）
7、6.2.3.3 反应体系 总体积为 25 L, 模板 DNA 2 L，上下游引物（ 10 mol/L）各 0.5 L， dNTPs 2 L， MgCl2 2.5 L，10Buffer 2.5 L， Taq 酶 (5 U/L) 0.2 L，补充 ddH2O 至 25 L。 6.2.3.4 PCR 反应程序 94预变性 3 min； 94变性 30 s， 55退火 30 s， 72延伸 1 min ， 35 个循环； 72延伸 7 min。 6.2.3.5 电泳 取 10 L 产物与 2 L 的 6 加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶中。在 1TAE缓冲液中， 3 V/cm 4
8、 V/cm 电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。 6.3 结果判定 6.3.1 裂头属的裂头蚴判定 若从鱼体内检出的幼虫 大小若长 2mm20 mm，宽 2mm3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴（ 参见 附录 C）。 6.3.2 迭宫属的裂头蚴形态判定 若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小若长 0.5cm80 cm，宽 0.3cm1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不
9、分节，具有不规则的WS/T 5712017 4 皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴（ 参见 附录 C）。 6.3.3 核酸扩增结果 判定 6.3.3.1 目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立。 6.3.3.2 阔节裂头蚴特异引物扩增，出现 428 bp 的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴。 6.3.3.3 曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现 156 bp 的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴。 6.3.3.4 若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与 GenBank 上序列进行比对后定种。 WS/T 5712017 5 A A 附 录 A （ 资料 性附录
10、） 病原学资料 裂头蚴（ plerocercoid）是假叶目（ Pseudophyllidea）、裂头科（ Diphyllobothriidae）绦虫的第三期幼虫的总称。裂头科中的裂头属（ Dibothriocephalus） 又名 双叶槽属（ Diphyllobothrium）及迭宫属（ Spirometra）的裂头蚴可感染人体。 A.1 形态 A.1.1 裂头属的裂头蚴的形态 阔节裂头蚴长 2 mm20 mm，宽 2mm3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，裂头蚴皮层表面覆盖微毛，长度
11、约 1.5 m。 A.1.2 迭宫属的裂头蚴形态 曼氏裂头蚴长 0.5cm80 cm，宽 0.3cm1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶。 A.2 生活史 阔节裂头绦虫 成虫寄生在人以及犬、猫、猪等动物的小肠内。虫卵随宿主粪便排出后，在 1525的水中，经过 7d15d 的发育，孵出钩球蚴。当钩球蚴被剑水蚤吞食后，在其血腔内经过 2 周 3 周的发育成原尾蚴。当受感染的剑水蚤被小鱼或幼鱼吞食后，原尾蚴可在鱼的肌肉、性腺、卵 内 发育为裂头蚴，裂头蚴并可随着鱼卵排出。当 大 鱼吞食 含有裂头蚴的 小鱼或
12、鱼 卵后，裂头蚴可侵入大鱼的肌肉组织内继续生存 ， 直到终宿主食入带裂头蚴的鱼时，裂头蚴方能在其肠内经 5 周 6 周发育 为 成虫。成虫在终宿主体内可活 5 年 13 年。 可感染阔节裂头蚴的第二中间宿主有：白斑狗鱼（ Esox lucius）、 江鳕 （ Lota lota）、河鲈 （ Perca fluviatilis）、 三刺鱼 （ Gasterosteus aculeatus）、 樱花钩吻鲑 （ Oncorhynchus masou）、 鮻 鱼（ Liza haematocheila）、 溪红点鲑 （ Salvelinus fontinalis） 、 虹鳟鱼 （ Oncorhynch
13、us mykiss） 、 雅罗鱼属鲤 （ Leuciscus rutilus）、八目鳗（ Lampetra japonicum）等。 曼氏迭宫绦虫的成虫寄生在猫、犬及食肉野生动物为终宿主的小肠内，虫卵随宿主粪便排出体外，在适宜温度下，经过 2 周 5 周发育孵出六钩蚴，被剑水蚤吞食后发育成原尾蚴，原尾蚴被蛙类吞食可发育成裂头蚴，人吞食含有裂头蚴的第二中间宿主可引起曼氏裂头蚴病。可感染曼氏裂头蚴的第二中间宿主为蛙类；鸟类、蛇类、猪可作为转续宿主。 WS/T 5712017 6 B B 附 录 B （规范性附录） 与检测相关的技术方法 B.1 试剂 配制 B.1.1 胃蛋白酶消化液 胃蛋白酶 2
14、g，浓盐酸 0.7 mL，加蒸馏水至 100 mL，现用现配。 B.1.2 Tris-乙酸电泳缓冲液（ TAE） 三羟甲基氨基甲烷（ Tris碱） 242 g， 冰乙酸 57.1 mL， pH 8.0的 0.5 mol/L EDTA液 100 mL， 加蒸馏水定容至 1000 mL， 制成 50TAE缓冲液，混匀 4保存备用。临用前 50倍稀释。 B.1.3 1TAE使用液 50 TAE 20 mL，加蒸馏水定容至 1000 mL，混匀备用。 B.1.4 10 mg/mL溴化乙锭液 溴化乙锭 1 g，加蒸 馏水定容至 100 mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。 B.1.5 1.5%琼脂糖
15、凝胶 琼脂糖 1.5 g，加 1TAE定容至 100 mL，完全融化后，溶液冷却至 60，加 10 mg/mL 溴化乙锭 5 L（终浓度 0.5 g/mL)，轻轻混匀后，制备凝胶。 B.1.6 6加样缓冲液 溴酚蓝 0.25 g，蔗糖 40 g，加蒸馏水至 100 mL。置 4保存备用。 B.1.7 商品化试剂盒 Taq酶、 dNTP等核酸提取及 PCR试剂可选用商品化试剂和试剂盒。 B.2 引物模板 裂头绦虫幼虫相关引物见表 B.2 表 B.2裂头绦虫幼虫相关引物 引物名称 引物编 号 序列 片段大小 /bp 裂头蚴 ITS 通用引物 18S-DF1 5-ACTTGATCATTTAGAGGA
16、AGT-3 1409 28S-DR4 5-CTCCGCTTAGTGATATGCT-3 裂头蚴 Cox1 通用引物 JB6 5-GATAGTAAGGGTGTTGA-3 650 JB5R 5-CAAGTATCRTGCAAAATATTATCAAG-3 阔节裂头蚴特异引物 Dl/Dn-1805F 5-CAGTGGGAATGGTGCTTGTAATGT-3 428 WS/T 5712017 7 Dl-2211R 5-TAACCTTTACTTATAACTACT-3 曼氏裂头蚴特异性引物 F965 5-CTTGGCTTTATATGATTTAAATAG-3 156 R1120 5-GTTTGGTGCACAGTA
17、CGTTTTAAAA-3 B.3 DNA的提取 B.3.1 挑取单条待鉴定虫体放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，半小时换一次水，重复洗涤 3次，洗涤完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将离心管中虫体碾碎，加入 180 l Buffer ATL， 20 l蛋白酶 K，混匀后于 56孵育 13 h至消化完全，期间不时 振荡摇晃。 B.3.2 消化完全后，漩涡震荡 15 s，加 200 l Buffer AL，立即漩涡振荡混匀，再加入 200 l 乙醇 (96 100%)，漩涡振荡混匀。 B.3.3 离心柱置于收集管上，将上一步的混合物吸入离心柱中， 8000 r/min离心 1 min，弃收集管。 B
18、.3.4 将离心柱置于新的收集管中，加 500 l Buffer AW1， 8000 r/min离心 1 min，弃收集管。 B.3.5 将离心柱置于新的收集管中，加 500 l Buffer AW2， 14000 r/min离心 3 min，弃收集管。 B.3.6 将离心柱置于灭菌的 1.5 ml离心管中，加入 200 l Buffer AE室温孵育 1 min， 8000 r/min离心 1 min，离心所得 DNA于 -20冰箱保存备用（重复该步骤可扩大 DNA回收率 ）。 B.4 实验试剂代码解释 （试剂盒自带） Buffer AL：裂解缓冲液（ Lysis buffer） Buffe
19、r AW1：洗涤缓冲液 1 Buffer AW2：洗涤缓冲液 2 Buffer ATL ：组织溶解缓冲液 Buffer AE：溶解缓冲液 WS/T 5712017 8 C C 附 录 C （资料性附录） 裂头蚴实物图 C.1 白 鱼 肌肉中的阔节裂头蚴 见 图 C.1 图 C.1 C.2 鳟 鱼肌肉中的阔节裂头蚴 见 图 C.2 图 C.2 C.3 蛙体内的 曼氏裂头蚴 见图 C.3 图 C.3 C.4 蛇体的 曼氏裂头蚴 见图 C.4 WS/T 5712017 9 图 C.4 注： 图 C.1来自 参考自文献： Tom Scholz, Hector H. Garcia, Roman Kuch
20、ta, Barbara Wicht. Update on the Human Broad Tapeworm (Genus Diphyllobothrium), Including Clinical Relevance.JClin Microbiol Rev. 2009 January; 22(1): 146160. doi: 10.1128/CMR.00033-08 图 C.2、 C.3、 C. 4 为检测样品自 己 拍摄 . WS/T 5712017 10 参 考 文 献 1 吴观陵 . 人体寄生虫学 . 第 4 版 . 北京 : 人民卫生出版社 , 2013. 2 Scholz T, Ga
21、rcia HH, Kuchta R, Wicht B. Update on the human broad tapeworm (genus diphyllobothrium), including clinical relevance. Clin Microbiol Rev. 2009, 22(1):146-160. 3 余森海 , 许隆祺 . 人体寄生虫学彩色图谱 . 第 1 版 . 北京 : 中国科学技术出版社 , 1992. 4 刘自逵 , 刘国华 , 戴荣四 , 刘伟 , 李芬 , 等 . 湖南省猬迭宫绦虫的线粒体 cox1 和 nad1 基因的序列测定及种系发育分 析 . 畜牧兽医学
22、报 . 2010, 41: 463-468. 5 Wicht B, Ruggeri-Bernardi N, Yanagida T, Nakao M, Peduzzi R, et al. Inter-and intra-specific characterization of tapeworms of the genus Diphyllobothrium (Cestoda: Diphyllobothriidea) from Switzerland, using nuclear and mitochondrial DNA targets. Parasitol Int. 2010, 59: 35-39. 6 SH Chen, L Ai,YN Zhang, JX Chen, WZ Zhang, et al. Molecular Detection of Diphyllobothrium nihonkaiense in Humans, China. Emerg Infect Dis, 2014,20:315318. _
