1、 Numro de rfrence ISO 23753-2:2005(F) ISO 2005NORME INTERNATIONALE ISO 23753-2 Premire dition 2005-11-01Qualit du sol Dtermination de lactivit des dshydrognases dans les sols Partie 2: Mthode au chlorure de iodottrazolium (CIT) Soil quality Determination of dehydrogenase activity in soils Part 2: Me
2、thod using iodotetrazolium chloride (INT) ISO 23753-2:2005(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur
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6、ion rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO d
7、ans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Version franaise parue en 2011 Publi en Suisse ii ISO 2005 Tous droits rservsISO 23753-2:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs iiiSommai
8、re Page Avant-propos .iv Introduction.v 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives.1 3 Principe 1 4 Ractifs et produits.2 5 Appareillage .3 6 Mode opratoire.3 7 Calculs3 8 Rapport dessai4 Bibliographie.5 ISO 23753-2:2005(F) iv ISO 2005 Tous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internatio
9、nale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet ef
10、fet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales s
11、ont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Nor
12、mes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas av
13、oir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 23753-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 190, Qualit du sol, sous-comit SC 4, Mthodes biologiques. LISO 23753 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Qualit du sol Dtermination de lactivit des dshyd
14、rognases dans les sols: Partie 1: Mthode au chlorure de triphnylttrazolium (CTT) Partie 2: Mthode au chlorure de iodottrazolium (CIT) ISO 23753-2:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs vIntroduction La microflore du sol est responsable de la dcomposition et de la transformation des matires organiques,
15、de la stabilit de sa structure et des cycles du carbone, de lazote, du soufre et du phosphore. Les dshydrognases, en tant quenzymes de la chane respiratoire, jouent un rle fondamental dans la production dnergie par les organismes. Elles permettent loxydation des composs organiques en transfrant deux
16、 atomes dhydrogne. Les dshydrognases sont des composants essentiels du systme enzymatique des micro-organismes. Lactivit des dshydrognases peut donc tre utilise comme indicateur des ractions biologiques doxydorduction ainsi que pour mesurer lactivit microbienne dans le sol. NORME INTERNATIONALE ISO
17、23753-2:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs 1Qualit du sol Dtermination de lactivit des dshydrognases dans les sols Partie 2: Mthode au chlorure de iodottrazolium (CIT) 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO 23753 spcifie une mthode de dtermination de lactivit des dshydrognases dans le sol
18、 laide de chlorure de 2-(4-iodophnyl)-3-(4-nitrophnyl)-5-phnylttrazolium (CIT). Comme la rduction par le CIT est moins sensible la prsence dO 2 , cette mthode est plus reproductible que la mthode au CTT dcrite dans lISO 23753-1. Elle ne sapplique pas la dtermination de lactivit des dshydrognases dan
19、s les couches suprieures (horizons L, F et H) des formes dhumus de fort faible activit microbienne (par exemple le mor), ou dans les sols prsentant des proprits rductrices (par exemple les sols saturs deau). 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplicatio
20、n du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition de la publication laquelle il est fait rfrence (y compris tous les amendements) sapplique. ISO 10381-6, Qualit du sol chantillonnage Partie 6: Lignes directrices pour la collec
21、te, la manipulation et la conservation de sols destins une tude en laboratoire des processus microbiens arobies ISO 10390, Qualit du sol Dtermination du pH ISO 11259, Qualit du sol Description simplifie du sol ISO 11465, Qualit du sol Dtermination de la teneur pondrale en matire sche et en eau Mthod
22、e gravimtrique 3 Principe La solution de CIT est ajoute un chantillon de sol et le mlange est incub 30 C pendant 18 h. Liodonitrottrazolium formazan (INTF) dgag est extrait lactone (dans le cas des sols humiques) et dos par photomtrie une longueur donde de 485 nm. NOTE 1 Cette mthode est fonde sur u
23、ne version modifie de la mthode dcrite dans la Rfrence 1. NOTE 2 Lactone est utilis comme solvant dextraction et il nest pas procd une extraction complte des chantillons. Dans le cas des sols ayant des caractristiques rductrices (par exemple les sols saturs deau), il convient de ne pas utiliser lact
24、ivit des dshydrognases pour mesurer lactivit biologique dans le sol 3 . Des composs abiotiques, tels que les composs du fer(II) ou les sulfures, peuvent rduire le CIT. ISO 23753-2:2005(F) 2 ISO 2005 Tous droits rservs4 Ractifs et produits 4.1 Sol Prlever et prparer des chantillons de sol comme spcif
25、i dans lISO 10381-6. Si les chantillons qui ont t tamiss ltat frais ne sont pas analyss immdiatement, ils peuvent tre conservs pendant une dure maximale de trois mois une temprature de 4 C. Dterminer la teneur en matire sche de lchantillon conformment lISO 11465. La conservation pouvant modifier lac
26、tivit enzymatique, il convient de ne pas comparer lactivit des dshydrognases dchantillons conservs pendant une dure diffrente. 4.2 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 1 mol/l. 4.3 Solution tampon tris, c = 0,1 mol/l. Dissoudre 12,11 g de tris (hydroxymthyl) aminomthane dans 600 ml deau distille et ajuster
27、 le pH : a) 7,7 pour les sols dont la teneur en carbonate est suprieure 2 %, ou b) 7,9 pour les sols dont la teneur en carbonate est infrieure ou gale 2 % en utilisant une solution dacide chlorhydrique 1 mol/l, puis complter 1 000 ml avec de leau distille. Dterminer le pH conformment lISO 10390. 4.4
28、 Solution de substrat (CIT) Peser 900 mg de chlorure de 2-(4-iodophnyl)-3-(4-nitrophnyl)-5-phnylttrazolium dans une fiole conique de 100 ml place sur un agitateur magntique et y ajouter 100 ml de la solution tampon tris (4.3). Ajouter ensuite le reste de la solution tampon tris et traiter le mlange
29、avec une sonde ultrasons pendant 1 min 2 min pour dissoudre le CIT autant que possible et obtenir une suspension. Enlever ultrieurement une partie de la suspension tout en agitant pour garder une solution homogne. Dterminer la texture du sol conformment lISO 11259. La solubilit du CIT dans la soluti
30、on tampon tris de pH 7,7 est au plus de 5 mg/ml. Au cours de lincubation, la dissolution du CIT dans la suspension provoque une lgre augmentation jusqu 7 mg/ml au maximum. Par consquent, il convient dutiliser 9 mg/ml. 4.5 Actone de qualit analytique 4.6 Solutions dINTF 4.6.1 Solution mre dINTF Peser
31、 50 mg diodonitrottrazolium formazan dans une fiole jauge de 100 ml, le dissoudre dans de lactone et complter 100 ml. 4.6.2 Solutions dtalonnage dINTF Introduire la pipette respectivement 0 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml et 4,0 ml de la solution mre dans une srie de fioles jauges de 50 ml. Ajout
32、er un peu dactone (utiliser le solvant dextraction dj utilis dans les chantillons), ajouter 10 ml de solution tampon tris et complter au trait avec de lactone afin dobtenir des concentrations respectives de 0 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g et 40 g dINTF par ml de mlange de solution tampon et dactone. Puis
33、que le CIT et lINTF sont sensibles la lumire, il convient de protger les solutions des rayons lumineux tout au long de lanalyse. ISO 23753-2:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs 35 Appareillage 5.1 Photomtre. 5.2 pH-mtre. 5.3 Tubes essai, par exemple de 2 cm de diamtre et dune capacit minimale de 30
34、ml (prise dessai de 5 g; voir galement lArticle 6). 5.4 tuve, rglable (30 1) C. 5.5 Fioles coniques, fioles jauges, pipettes et entonnoirs appropris. 5.6 Filtre plis, filtrage lent (90 s 100 s). 5.7 Sonde ultrasons. 5.8 Agitateur pour tubes essai. 6 Mode opratoire Peser 2,00 g 5,00 g de sol naturell
35、ement humide dans chacun de quatre tubes essai. Ajouter 2 ml 5 ml de la solution de substrat (4.4) trois chantillons. Introduire la pipette 2 ml 5 ml de solution tampon tris (4.3), au lieu de la solution de substrat (4.4), dans lchantillon blanc. Homogniser les chantillons sur lagitateur pour tubes
36、essai, obturer les tubes avec un bouchon en caoutchouc et les mettre incuber dans lobscurit 30 C pendant 18 h. Pour extraire le formazan dgag, ajouter 20 ml dactone aux chantillons et les laisser reposer 2 h labri de la lumire. Agiter les chantillons sur lagitateur 1 h, et de nouveau 2 h, aprs avoir
37、 ajout le solvant dextraction. Filtrer ensuite les chantillons en conditions de semi-obscurit laide dun filtre plis. Dans lheure qui suit, mesurer labsorbance des filtrats en fonction du point zro de la courbe dtalonnage par photomtrie une longueur donde de 485 nm. 7 Calculs Dterminer lactivit des d
38、shydrognases (pour des sols secs) laide de la courbe dtalonnage et de lquation suivante: () cs bs 100 DM V a mt = o a est lactivit des dshydrognases, en g/g de sol sec par heure; cs est la concentration en INTF moyenne de lchantillon complet, en g/ml; bs est la concentration en INTF moyenne de lchan
39、tillon blanc, en g/ml; V est le volume de la solution = volume de la solution de substrat ou de la solution tampon (5 ml) + volume du solvant dextraction (25 ml), en ml; m est la masse initiale de lchantillon de sol, en g; DM est la teneur en matire sche de lchantillon conformment lISO 11465, en pou
40、rcentage; t est le temps dincubation (ici 18 h), en h. ISO 23753-2:2005(F) 4 ISO 2005 Tous droits rservs8 Rapport dessai Le rapport dessai doit faire rfrence la prsente partie de lISO 23753 et comporter les lments suivants: a) lidentification de lchantillon; b) la dure et la temprature de conservati
41、on (4.1); c) la classe de texture du sol; d) la teneur en carbonate du sol (voir Rfrence 7); e) les rsultats dessai; f) tous les dtails facultatifs et tous les carts par rapport aux spcifications de la prsente partie de lISO 23753, ainsi que tous les effets susceptibles davoir eu une incidence sur l
42、es rsultats. ISO 23753-2:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs 5Bibliographie 1 SPOTHELFER-MAGANA, J., THALMANN, A. and SCHWEIKLE, V., Methode zur Bestimmung der Dehydrogenaseaktivitt von Bden unter Einsatz von Iodotetrazoliumchlorid (INT): Chemische Reduktion in autoklavierten sowie bestrahlten Bden
43、sowie der Einflu der Inkubationstemperatur und zeit. Agribiol. Res., 46, 1993, pp. 250268 2 THALMANN, H., Zur Methodik der Bestimmung der Dehydrogenaseaktivitt im Boden mittels Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). Landwirtsch. Forsch., 21, 1968, pp. 243258 3 GLATHE, H. and THALMANN, H., Microbial acti
44、vity and its relationship to fertility characteristics of some agricultural soils, with particular reference to dehydrogenase activity. Part 2. Zbl Bakt II, 124, 1970, pp. 2436 4 MERSI, W. VON and SCHINNER, F., An improved and accurate method for determining the activity of soils with iodotetrazoliu
45、m chloride. Bio. Fertil. Soils, 11, 1991, pp. 216220 5 HLINGER, R., Determination of dehydrogenase activity using TTC. In: Methods in soil biology. (SCHINNER, F., HLINGER, R., KANDELER, E. and MARGESIN, R. eds.). Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg/New York, 2nd ed., 1993 6 FUCHS, M., KOCH, C. and WI
46、LKE, B.-M., Modification of the determination of dehydrogenase activity using tetrazolium chloride for soils contaminated by heavy metals. VDLUFA-Schriftenreihe, 38, 1994, pp. 899902 7 ISO 10693, Qualit du sol Dtermination de la teneur en carbonate Mthode volumtrique ISO 23753-2:2005(F) ICS 13.080.30 Prix bas sur 5 pages ISO 2005 Tous droits rservs
