1、ICS 11.220 B 41 DB51 备案号：30905-2011 四川省地方标准 DB51/T 13022011 绵羊肺炎支原体 PCR 检测技术规范 Technical Specification for PCR Detection Method of Mycoplasma ovipneumoniae 2011 - 06 - 27 发布 2011 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 13022011 I 目 次 前 言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语与定义 1 4 设备和试剂 1 5 DNA提取 . 2 6 PCR扩增 . 3 7
2、PCR产物的电泳检测 . 3 8 结果判定 3 附录A（资料性附录） 试剂配制 5 DB51/T 13022011 II 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：西南民族大学 四川省畜禽繁殖改良总站。 本标准主要起草人：杨发龙 岳华 王永 汤承 傅昌秀。 DB51/T 13022011 1 绵羊肺炎支原体 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了绵羊肺炎支原体的PCR（聚合酶链式反应）检测方法。 本标准适用于绵羊肺炎支原体的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是
3、注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction （PCR） 是一种 分子生物学 技术，用于体外大量扩增特定的DNA片段。 3.2 引物 primer 是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条DNA模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条DNA模板链互补。 4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 P
4、CR 扩增仪 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.6 高压灭菌锅 DB51/T 13022011 2 4.1.7 恒温水浴锅 4.1.8 移液器（0.1 L-10L、2 L-20L、20 L-200L、200 L-1000L） 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10 mol/L） P1：5-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3 P2：5-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3 4.2.2 DNA 提取试剂 蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异
5、戊醇、无水乙醇。 4.2.3 PCR 反应试剂 Taq DNA聚合酶（5U/L） 、MgCl 2（25mmol/L） 、dNTP（每种浓度为 2.5mmol/L） 、10PCR Buffer(无Mg2+)。 4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A） 4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A） 4.2.6 6上样缓冲液（6 Loading Buffer） 4.2.7 琼脂糖（电泳级） 4.2.8 溴化乙锭溶液（1mg/mL） 4.2.9 DNA 分子量标准（100bp，200bp ,300bp,400bp,500bp,600bp） 4.2.10 水 所用水应符合GB/T 6682中三级水（三蒸
6、水）规格。 5 DNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 组织样本 肺等组织样本，按1g加入1mL的STE，进行研磨，3000r/ min进行离心10min，取上清液，12000r/min进行离心20min，弃上清，沉淀用于DNA提取。 5.1.2 棉拭子 将鼻腔拭子等棉拭子浸入1mL的STE缓冲液中30min，反复挤压，然后以12000r/min离心20min，弃去上清，收集沉淀用于DNA提取。 5.1.3 胸腔渗出液 取500 L胸腔渗出液，加入500 L STE缓冲液，混匀，12000r/m in离心20min, 弃上清，收集沉淀用于DNA提取。 DB51/T 13022011 3 5
7、.1.4 液体培养物 12000r/min离心2 0min, 弃上清，收集沉淀用于DNA提取。 5.2 DNA 提取方法 向上述沉淀中加入500 L STE缓冲液，使其重悬。加入10%SDS溶液20 L，20mg/mL 蛋白酶K10 L，混匀，在56水浴60min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1 ），混匀，12000r/min离心5min。转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min离心5min。取上清，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20沉淀30min，12000r/min离心5min，弃去上清液。用1mL 70%乙醇漂洗，重
8、复2次-3次，12000r/min离心5min。室温干燥，DNA沉淀用25 L无菌三蒸水溶解作为模板，-20保存备用。 6 PCR 扩增 每次对检测样品进行 PCR 扩增时，均需要设置阳性和空白对照。 PCR反应总反应体系 25L， 包括以下成份： 10PCR Buffer 2.5L、 MgCl2（25mM） 2L 、 dNTP(2.5mM) 2L、 Taq DNA聚合酶(5U/L) 0.125L、引物P1（10mo l/L）1L、引物P2（10mol/L）1L、水14.375L、模板DNA（空白对照用水代替）2L。 PCR 反应条件为 95 预变性 5min，然后进行 95 1min, 50
9、 1min, 72 30s 的循环，进行 35个循环，最后 72 延伸 10min，4保存。 7 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。取 5L PCR 产物与 1L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统进行拍照。 8 结果判定 阳性对照出现一条 360bp 左右大小的条带，且无模板空白对照不出现条带（见图 1） 。 在满足上述条件的情况下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 360bp 左右的条带判定为阳性（+） ；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 3
10、60bp 左右的条带判定为阴性（）。 DB51/T 13022011 4 说明： M DNA 分子量标准； P 阳性对照； N 阴性对照。 图 1 阴、阳性对照 PCR 电泳图 DB51/T 13022011 5 AA 附 录 A （资料性附录） 试剂配制 试剂名称 1STE 缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 2TAE 电泳缓冲液（pH8.0） 50TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 242g EDTA 37.2g 冰乙酸 57.1mL 加双蒸水至 1000mL，应用前用双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 32%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2g 1TAE 电泳缓冲液 100mL 将琼脂糖放入 TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60左右时加入溴化乙锭（终浓度 0.5g/mL），混匀，均匀倒板，厚度为 3mm-5mm。 _
