1、August 2006 Preisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nurmit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 67.050!,cw“9645984www.din.deDDIN-Fachbericht CEN/TR 15298Lebensmittel Probenvorbereitung fr die Myco
2、toxinanalytik Vergleich zwischen Trockenvermahlung und Aufschlmmung;Deutsche Fassung CEN/TR 15298:2006Foodstuffs Sample comminution for mycotoxins analysis Comparison between dry milling and slurry mixing;German version CEN/TR 15298:2006Produits alimentaires Prparation dchantillons gros volume pour
3、lanalyse des mycotoxines Comparaison entre broyage sec et broyage par voie humide;Version allemande CEN/TR 15298:2006Alleinverkauf durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 22 SeitenDIN-Fachbericht CEN/TR 15298:2006-08 2 Nationales Vorwort Der diesem Fachbericht zugrunde liegend
4、e CEN-Fachbericht CEN/TR 15298 wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensmittelanalytik Horizontale Verfahren“, Arbeitsgruppe 5 Biotoxine (Mycotoxine und Phycotoxine)“ erstellt. Die Mitarbeit des DIN wird ber den Arbeitsausschuss Biotoxine“ des Normen-ausschusses Lebensmittel und landwirtschaft
5、liche Produkte (NAL) wahrgenommen. Dieses Dokument dient zur Ausgestaltung der Richtlinie der Kommission der Europischen Gemeinschaft 98/53/EG ber die Probenahmeverfahren und Analysemethoden fr die amtliche Kontrolle bestimmter Lebensmittel auf Einhaltung der Hchstgehalte fr Kontaminanten in Lebensm
6、itteln. Es beschreibt den Vergleich der verschiedenen Probenaufbereitungsverfahren fr die Mycotoxinanalytik und gibt dem Anwender wichtige Hinweise fr eine fachgerechte Probenvorbereitung. TECHNISCHER BERICHT TECHNICAL REPORT RAPPORT TECHNIQUE CEN/TR 15298 Mai 2006 ICS 67.050 Deutsche Fassung Lebens
7、mittel Probenvorbereitung fr die Mycotoxinanalytik Vergleich zwischen Trockenvermahlung und Aufschlmmung Foodstuffs Sample comminution for mycotoxins analysis Comparison between dry milling and slurry mixing Produits alimentaires Prparation dchantillons gros volume pour lanalyse des mycotoxines Comp
8、araison entre broyage sec et broyage par voie humide Dieser Technische Bericht (TR) wurde vom CEN am 30. November 2005 als eine knftige Norm zur vorlufigen Anwendung angenommen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Gri
9、echenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern.EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG E
10、UROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2006 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. CEN/TR 15298:2006 DCE
11、N/TR 15298:2006 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 Einleitung.3 1 Anwendungsbereich .4 2 Prfverfahren .5 3 Ergebnisse und deren Diskussion.5 4 Danksagung 18 Literaturhinweise . 19 CEN/TR 15298:2006 (D) 3 Vorwort Dieser Technische Bericht (CEN/TR 15298:2006) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 Lebensm
12、ittelanalytik Horizontale Verfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Es wird auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen. CEN und/oder CENELEC sind nicht dafr verantwortlich, einige oder alle diesbezglichen Patentrechte zu ident
13、ifizieren. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diesen Europischen Technischen Bericht anzukndigen: Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxe
14、mburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. Einleitung Seit dem 01.01.1999 sind EG-Richtlinien zu Aflatoxinen in Kraft getreten, die Stichprobenanweisungen
15、ent-halten, die zu Probenmassen von bis zu 30 kg fhren. Das warf die Frage auf, wie mit diesen relativ groen Proben die Anforderung Alle Laborproben sind fein zu zermahlen und sorgfltig unter Verwendung eines Verfahrens zu vermischen, mit dem nachweislich eine vollstndige Homogenisierung erreicht we
16、rden kann.“ 1 erfllt werden kann. Weil die Analysenprobe aus dieser groen Probe entnommen wird, ist der kritische Schritt dabei die Entnahme einer reprsentativen Einzelprobe. Als solches war dieses Thema in der Vergangenheit Gegenstand verschiedener Untersuchungen. Von Dickens und Satterwhite 2 wurd
17、e eine Mhle entwickelt, mit der Erdnussproben von bis zu 25 kg gehandhabt werden konnten. Von ihnen wurden Ergebnisse von Untersuchungen an 5-kg-Proben vorgelegt, denen 50-g-Teilproben entnommen wurden, jedoch wurden keine Angaben zu greren Proben vorgelegt. Von Velasco und Morris 3 wurde die Verwen
18、dung einer wssrigen Aufschlmmung in Betracht gezogen, um feinere Teilchen und eine gleichmigere Korngrenverteilung zu erhalten. Ein weiterer Vorteil der Herstellung einer Aufschlmmung ist das Vermeiden von Klumpenbildung bei Proben mit einem hohen lgehalt. Von ihnen wurden Versuche mit unterschiedli
19、chen Matrices und Probenmassen von bis zu 4,5 kg dargelegt, wobei erwhnt wurde, dass die Herstellung der Aufschlmmung nur durch das Fassungsvermgen der Ausrstung begrenzt ist. Von Whitaker et al. 4 wurde ein Kompromiss in Betracht gezogen. Von ihnen wurde eine Aufschlmmung aus einer Probe hergestell
20、t, die zuerst durch einen anderen Vermahlungsprozess zerkleinert worden war. Aufgrund der Vorschriften des USDA (Landwirtschaftsministerium der USA) wurde die Menge auf nur 1 100 g beschrnkt. Dennoch entwickelte sich ihr Verfahren trotz dieser Beschrnkung zum besten alternativen Verfahren fr Lebensm
21、ittel, das bei Aflatoxin in Erdnssen Anwendung findet 5. Dorner und Cole 6 fingen von neuem an: mit der 218-kg-Probe von rohen, geschlten Erdnssen zur Analyse in offiziell von dem USDA zugelassenen Laboratorien. Die Variabilitt wurde durch Vermahlen mit vier verschiedenen Mhlen verglichen, jedoch nu
22、r mit einem Teilprobenumfang von bis zu 4 kg. So blieb die Frage nach dem mglichen Ergebnis bei Proben mit 21,8 kg unbeantwortet. Ihre statistischen Daten, insbesondere die Werte fr CV, waren bei 2-kg- und 4-kg-Teilproben ungnstiger als die Daten, die bei der Anwendung des Aufschlmmungsverfahrens er
23、reicht werden knnen. Von Scholten und Spanjer 7 wurden Daten zur Herstellung von Aufschlmmungen fr Proben von bis zu 10 kg verffentlicht, wobei in dem Laboratorium von Wiertz, Eggert und Jrissen hnliche Erfahrungen gesammelt wurden, sogar bei der Verwendung von Proben von bis zu 30 kg. Die Daten von
24、 letzteren sind in diesem Bericht zusammengestellt. Weltweit werden jedoch Mhlen fr Teilproben bevorzugt, weil sie leicht anzuwenden sind und die Proben schnell zu Analysenproben zerkleinern. Von Calori-Domingues et al. 8 wurde das mit einer Poster-Prsentation auf dem X. Internationalen IUPAC-Sympos
25、ium zu Mycotoxinen und Phykotoxinen im Mai 2000 bewiesen. Von ihnen wurde die Variabilitt bei der Aflatoxinanalyse in Erdnssen im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung durch Vermahlen mit einer RAS-Mhle untersucht. Leider wurden jedoch nur Proben bis zu 5 kg untersucht. Folglich wurde von den Labo
26、ratorien des Inspectorate for Health Protection (Aufsichtsamt fr Gesundheits-schutz), einer exekutiven Einheit der Dutch Food and non-food Authority, und von Wiertz, Eggert und Jrissen, CEN/TR 15298:2006 (D) 4 einem Mitglied der Eurofins Scientific group, die Entscheidung getroffen, neue Untersuchun
27、gen mit folgenden Zielstellungen durchzufhren: 1. Welche CV-Werte werden beim Vermahlen von 10-kg-Proben erreicht? und 2. Werden dabei die richtigen Werte fr Aflatoxin ermittelt? Die Auswahl der Matrices wurde auf einer Sitzung der CEN/TC 275/WG 5 (Comit Europen de Normalisation, Technisches Komitee
28、 275, Arbeitsgruppe 5, Biotoxine) unter Bercksichtigung der gegenwrtigen und zuknftigen Gesetzgebung fr verschiedene Arten von Mycotoxinen und Lebensmitteln errtert. Die Verbindung beider Punkte fhrt zu der Schlussfolgerung, dass viele Matrices, in Form von getrocknetem, nicht zerkleinertem oder gem
29、ahlenem Rohmaterial, zu bercksichtigen sind. Unterschiede in der Probenmasse, z. B. zwischen Nssen und Gewrzen, liegen auch vor. Vorschlge fr reprsentative Waren sind: Getreide, weil fr dieses Grundnahrungsmittel Richtlinien zu Aflatoxinen, Ochratoxin A und DON vor-liegen; Rosinen, weil sie in den R
30、ichtlinien zu Aflatoxinen und Ochratoxin A enthalten sind; Paprikapulver als Beispiel fr eine gemahlene Ware. In der Praxis stellte sich jedoch heraus, dass der limitierende Faktor die Verfgbarkeit von natrlich kontami-nierten Partien war, die fr diese Untersuchungen verwendet werden konnten. Die da
31、rgelegten Ergebnisse zeigen, was genau untersucht worden ist. Nach diesen Versuchen wurde die ausfhrliche Arbeit von Schatzki und Toyofuku 9, von denen die Korngrenverteilungen bei Pistazienbrei ermittelt wurde, vorgelegt. Das fhrte zu einer gemeinsamen Prsentation auf dem 2. World-Mycotoxin-Forum,
32、Februar 2003, in den Nieder-landen 10. Dieser Bericht ist eine Zusammenfassung beider Untersuchungen. 1 Anwendungsbereich Die Trockenvermahlung und Aufschlmmung als Zerkleinerungsschritt vor der Mycotoxinanalyse wurden mit-einander verglichen. Das bezieht sich auf die EG-Gesetzgebung, in der Stichpr
33、obenanweisungen fr bis zu 30 kg enthalten sind. Proben von Kakao, Rohkaffee, Mandeln und Pistazien von 10 kg wurden mit einer RAS-Mhle gemahlen und alle drei Teilproben wurden vollstndig auf Aflatoxin B1oder Ochratoxin A analysiert. Die Unterschiede bei den Analysenergebnissen sind durch die Messung
34、en der Korngrenverteilungen von beiden Vermahlungsarten begrndet. Die erhaltenen Daten wurden auf der Grundlage der Variationskoeffi-zienten (CV) fr verschiedene Mahlverfahren mit Literaturangaben verglichen. Die CV-Werte fr die Trocken-vermahlung lagen im Allgemeinen nicht unter 20 % fr Aflatoxin B
35、1-Konzentrationen in Erdnssen von bis zu 38 g/kg, whrend bei Aufschlmmungen CV-Werte unter 5 % bei Aflatoxin B1-Konzentrationen in Pistazien von bis zu 4 g/kg erreicht werden knnen. Die Messungen zeigten auch den mglichen Unterschied zwischen beiden Vermahlungsarten im Mycotoxingehalt einer Probe. D
36、as knnte zu falsch positiven oder negativen Ergebnissen fhren, wenn eine Partie angesichts des Probenergebnisses zurckgewiesen oder angenommen wird. Es wurde abschlieend festgestellt, dass Aufschlmmungen kleinere Teilchen enthalten als trocken vermahlene Proben und somit den kleinsten mglichen CV-We
37、rt erzeugen, was wiederum zu einer besseren Probenhomogenisierung fhrt. CEN/TR 15298:2006 (D) 5 2 Prfverfahren 2.1 Gerte 2.1.1 Suspensionsmischer, Suspensionsmischer Silverson Typ EX-Mischer1)2.1.2 RAS-Mhle, Romer Analytical Sampling mill1)brige Laborausrstung und Verfahren zur Herstellung von Aufsc
38、hlmmungen wie vorstehend beschrieben (siehe 7 und 9). Die RAS-Mhle wurde entsprechend dem Handbuch (2. Ausgabe, Januar 1998) des Herstellers angewendet. Vor der Trockenvermahlung wurden die Pistazienproben ber Nacht bei minus 20 C tiefgefroren. 2.2 Reagenzien und Materialien Aflatoxin-Bestimmungen w
39、urden nach der Beschreibung in EN 14123 durchgefhrt. Bestimmungen von Ochratoxin wurden in Kakao und rohen Kaffeebohnen nach der Beschreibung in EN 14132 durchgefhrt, einschlielich Qualittskontrolle. Der einzige Unterschied ist, dass die Fluoreszenzdetektion von Ochratoxin A nach der Verffentlichung
40、 von Zimmerli und Dick 11 durchgefhrt wurde. 2.3 Durchfhrung Fr jede Ware wurden die Versuche nach folgender Verfahrensweise durchgefhrt: 1) Probenahme nach der EG-Richtlinie, was zu einer 10-kg-Probe fhrt; 2) Vermahlen der 10-kg-Probe mit einer RAS-Mhle mit einem Teilstromverhltnis (Split-Verhltnis
41、) von 10 %; 3) Entnahme einer trockenen Probe aus dem 10-%-Teil, wie blich fr Anwender der RAS-Mhle (Teilprobe A); 4) Aufschlmmen des verbliebenen Teils des 10-%-Teils der Probe (Teilprobe B); 5) Herstellen einer Aufschlmmung aus dem 90-%-Teil mit dem Silverson-Mischer (Teilprobe C); 6) Analyse der
42、drei Teilproben A, B und C mit HPLC-Verfahren. Auf diese Weise kann anschlieend der vollstndige Mycotoxingehalt in der Probe durch Berechnung rekonstruiert werden. 3 Ergebnisse und deren Diskussion Die Ergebnisse aller experimentellen Werte sind in der zweiten, dritten und vierten Spalte von Tabelle
43、 1 ange-geben. Sie umfassen die Messungen von Ochratoxin A in Kakao und rohen Kaffeebohnen und von Aflatoxinen, von denen fr diesen Zweck nur Aflatoxin B1von Bedeutung ist, in Mandeln, Pistazien und einer Probe aus gemischten Gewrzen (Gewrzmischung). Alle anderen Spalten von Tabelle 1 enthalten Zahl
44、en, die aus diesen Daten berechnet wurden. Aus der Masse jeder Teilprobe und deren Mycotoxingehalt kann 1) Silverson Typ EX-Mischer ist die Herstellerbezeichnung des Produktes, geliefert von Silverson Machines Ltd., Waterside, Chesham, Bucks, England. Romer Analytical Sampling (RAS)-Mhle ist die Her
45、stellerbezeichnung des Produktes, geliefert von Coring-Systems Diagnostics GmbH, Robert-Bunsen-Strae 4, D-64579 Gernsheim, Deutschland. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieses Technischen Berichtes und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produktes durch CEN. Gleichwertige P
46、rodukte drfen verwendet werden, wenn sie nachweisbar zu identischen Ergebnissen fhren. CEN/TR 15298:2006 (D) 6 berechnet werden, welchen Mycotoxingehalt die Gesamtprobe gehabt htte, wenn der Gehalt an der Probe als Gesamtheit bestimmt worden wre. Dieser berechnete Wert ist in der Spalte Probenwert“
47、an erster Stelle dargestellt, um die verschiedenen Vergleiche zu erleichtern, die im Abschnitt Ergebnisse und Diskussion angestellt werden. In den letzten drei Spalten sind der mathematische Mittelwert der Ergebnisse fr die Teilproben A, B und C, die Standardabweichung und der Variationskoeffizient
48、von diesen drei Messungen angegeben, die spter auch diskutiert werden. Die Ergebnisse mssen vom Anbeginn der Versuche bercksichtigt werden: dem Vermahlen der 10-kg-Probe mit einer RAS-Mhle, die zu einer Teilung der Ausgangsprobe in zwei Teilproben mit unterschiedlicher Masse fhrt. Wenn bei der tglic
49、hen Routineanalyse RAS-Vermahlen angewendet wird, folgt diesem Schritt die Entnahme einer Einzelprobe aus der kleinsten Teilprobe zur weiteren Reinigung und chemischen Analyse. Diese Situation ist vergleichbar mit den Ergebnissen fr die Teilprobe A in diesem Versuch, mit dem entscheidenden Unterschied, dass die fr die Teilprobe
