1、Mrz 2007DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 67.100.01!,v7Y“9
2、832054www.din.deDDIN EN ISO 14637Milch Bestimmung des Harnstoffgehaltes Enzymatisches Verfahren mit pH-nderung (Referenzverfahren)(ISO 14637:2004);Deutsche Fassung EN ISO 14637:2006Milk Determination of urea content Enzymatic method using difference in pH (Reference method) (ISO 14637:2004);German v
3、ersion EN ISO 14637:2006Lait Dtermination de la teneur en ure Mthode enzymatique par mesurage de pH diffrentiel (Mthode de rfrence)(ISO 14637:2004);Version allemande EN ISO 14637:2006Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 16 SeitenDIN EN ISO 14637:200
4、7-03 2 Nationales Vorwort Diese Europische Norm fllt in den Zustndigkeitsbereich des Technischen Komitees CEN/TC 302 Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungsverfahren“ (Sekretariat: NEN Niederlande). Die ihr zu Grunde liegende Internationale Norm ISO 14637:2004 wurde vom Unterkomitee SC
5、 5 Milch und Milch-produkte“ (Sekretariat: NEN Niederlande) des Technischen Komitees ISO/TC 34 Lebensmitteler-zeugnisse“ (Sekretariat: MSZT Ungarn) ausgearbeitet. Auf Grund der Ergebnisse des einstufigen Annahmeverfahrens wurde ISO 14637:2004 als Europische Norm EN ISO 14637 bernommen. Die Mitarbeit
6、 des DIN beim Europischen Komitee fr Normung (CEN) wird fr den chemisch-physikalischen Arbeitsbereich des CEN/TC 302 Milch und Milchprodukte Probenahme- und Untersuchungs-verfahren“ (Sekretariat: NEN Niederlande) ber den DIN-Arbeitsausschuss Chemische und physikalische Untersuchung von Milch und Mil
7、chprodukten“ des Normenausschusses Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) wahrgenommen. Fr die in diesem Dokument zitierten Internationalen Normen wird im Folgenden auf die entsprechenden Deutschen Normen hingewiesen: ISO 707 siehe DIN EN ISO 707 ISO 5725-1 siehe DIN ISO 5725-1 ISO 5725
8、-2 siehe DIN ISO 5725-2 Nationaler Anhang NA (informativ) Literaturhinweise DIN EN ISO 707, Milch und Milchprodukte Leitfaden zur Probenahme DIN ISO 5725-1, Genauigkeit (Richtigkeit und Przision) von Messverfahren und Messergebnissen Teil 1: Allgemeine Grundlagen und Begriffe DIN ISO 5725-2, Genauig
9、keit (Richtigkeit und Przision) von Messverfahren und Messergebnissen Teil 2: Grundlegende Methode fr die Ermittlung der Wiederhol- und Vergleichprzision eines vereinheitlichten Messverfahrens EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN ISO 14637 Dezember 2006 ICS 67.100.10 Deutsche Fassung
10、 Milch Bestimmung des Harnstoffgehaltes Enzymatisches Verfahren mit pH-nderung (Referenzverfahren) (ISO 14637:2004) Milk Determination of urea content Enzymatic method using difference in pH (Reference method) (ISO 14637:2004) Lait Dtermination de la teneur en ure Mthode enzymatique par mesurage de
11、pH diffrentiel (Mthode de rfrence) (ISO 14637:2004) Diese Europische Norm wurde vom CEN am 13. November 2006 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Sta
12、tus einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch
13、, Franzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrummitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normung
14、sinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republi
15、k, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern.EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2006 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltwei
16、t den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten. Ref. Nr. EN ISO 14637:2006 DEN ISO 14637:2006 (D) 2 Inhalt Seite Vorwort 3 1 Anwendungsbereich .4 2 Begriffe .4 3 Kurzbeschreibung .4 4 Chemikalien4 5 Gerte5 6 Probenahme .6 7 Vorbereitung der Untersuchungsprobe 6 8 Durchfhrung.6 8.1 Allgemeines6 8.2
17、 Blindbestimmung.6 8.3 Kalibrierung7 8.4 berprfen der Kalibrierung.8 8.5 Bestimmung .8 8.6 berprfen der Stabilitt.8 8.7 berprfen der Verunreinigung der Elektroden.8 8.8 Reinigungsverfahren.8 9 Wartung der Elektroden 9 9.1 Regeneration9 9.2 Intensive Regeneration .9 10 Berechnung und Angabe der Unter
18、suchungsergebnisse.9 10.1 Berechnung9 10.2 Angabe der Untersuchungsergebnisse 9 11 Przision 10 11.1 Ringversuch 10 11.2 Wiederholprzision. 10 11.3 Vergleichprzision 10 12 Untersuchungsbericht . 10 Anhang A (informativ) Differenzial-pH-Messgert 11 Anhang B (informativ) Ringversuche. 12 Literaturhinwe
19、ise . 14 EN ISO 14637:2006 (D) 3 Vorwort Der Text von ISO 14637:2004 wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 Lebensmittelerzeugnisse“ der Internationalen Organisation fr Normung (ISO) erarbeitet und als EN ISO 14637:2006 durch das Technische Komitee CEN/TC 302 Milch und Milchprodukte Probenahme- und
20、 Untersuchungsverfahren“ bernommen, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird. Diese Europische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Juni 2007, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis Ju
21、ni 2007 zurckgezogen werden. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Lu
22、xemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Rumnien, Schweden, Schweiz, Slowakei, Slowenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. Anerkennungsnotiz Der Text von ISO 14637:2004 wurde vom CEN als EN ISO 14637:2006 ohne irgendeine Abnderung ge
23、nehmigt. EN ISO 14637:2006 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Internationale Norm legt ein enzymatisches Verfahren fr die Bestimmung des Harnstoffgehaltes in Milch durch die Messung der pH-nderung fest. 2 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 2.1 Harnstoffgehalt Mass
24、enanteil von Substanzen, ermittelt nach dem in dieser Internationalen Norm beschriebenen Verfahren ANMERKUNG Der Harnstoffgehalt wird in Milligramm je Liter angegeben. 3 Kurzbeschreibung Urease wird der Untersuchungsprobe zugefgt, um Harnstoff in Ammoniak und Kohlendioxid zu spalten. Bei einem pH-We
25、rt von 6,7 hydrolysiert Ammoniak unter Freisetzung von Hydroxylionen sofort und Kohlendioxid setzt Protonen frei, die die Hydroxidionen teilweise neutralisieren. Das Gleichgewicht zwischen der Ammoniak- und Kohlendioxid-Hydrolyse und die daraus resultierende Neutralisation fhren zu einer nderung des
26、 pH-Wertes. Die nderung des pH-Wertes variiert als eine Funktion des Harnstoffgehaltes der Probe und wird unter Verwendung eines Differenzial-pH-Messgertes gemessen. 4 Chemikalien Wenn nicht anders angegeben sind ausschlielich analysenreine Chemikalien zu verwenden und destilliertes oder demineralis
27、iertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit. 4.1 Chemikalien fr die Harnstoffbestimmung 4.1.1 Pufferlsung, pH-Wert 6,7 1,777 g Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4), 1,388 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 7,600 g Kali-umchlorid (KCl), 1,00 g Natriumazid (NaN3), 0,010 g Acetazolamid (5-Acetamid-1,3,4
28、-thiadiazol-2-sulfonamid), 1,040 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 6 H2O), 2 g Triton X100, 1 g Brij 35 und 20 ml LM11)werden in einem 1 000-ml-Messkolben (5.5) aufgelst. Mit Wasser wird bis zur Marke aufgefllt und durchmischt. Die Pufferlsung kann 6 Monate aufbewahrt werden, wenn sie bei 4 C gel
29、agert wird. 4.1.2 Urease-Enzym-Lsung 360 mg Urease-Lyophilisat (EC 3.5.1.5) werden in 1 ml einer 50%igen (Volumenanteil) wssrigen Glycerol-Lsung gelst. Die Aktivitt der erhaltenen Urease-Enzym-Lsung sollte 2 100 Einheiten/ml 300 Einheiten/ml2)betragen. Die Urease-Enzym-Lsung kann 6 Monate aufbewahrt
30、 werden, wenn sie bei 4 C gelagert wird. 1) Dieses Reinigungsmittel kann von Valetudo S.r.l., BG, Italien bezogen werden und ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produ
31、ktes durch ISO oder IDF. 2) Diese Einheit (oft als Internationale Einheit“ oder Standardeinheit“ bezeichnet) ist definiert als die Menge Enzym, die die Umwandlung von einem Mikromol des Substrates je Minute unter festgelegten Bedingungen umsetzt. EN ISO 14637:2006 (D) 5 4.1.3 Harnstoff-Standardlsung
32、 1,000 g trockener Harnstoff (N2H4CO) (im Trockenschrank unter Vakuum fr einen Tag bei (90 1) C getrocknet), 7,45 g Kaliumchlorid (KCl) und 1,0 g Natriumazid (NaN3) werden in einem 1 000-ml-Messkolben (5.5) gelst. Mit Wasser wird bis zur Marke aufgefllt und durchmischt. Die Harnstoff-Standardlsung k
33、ann 6 Monate aufbewahrt werden, wenn sie bei 4 C gelagert wird. 4.1.4 Nullwert-Milch 20 l Urease-Lsung (4.1.2) werden zu 1 ml Rohmilch gegeben. Es wird durchmischt und die so vorbereitete Rohmilch wird fr 10 min in einem Wasserbad (5.3) bei 40 C inkubiert. 4.2 Chemikalien fr die Reinigung und Wartun
34、g der Elektroden 4.2.1 Reinigungslsung 1,742 g Dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4), 1,361 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 7,455 g Kali-umchlorid (KCl), 1,00 g Natriumazid (NaN3), 2 g Triton X100, 2 g Brij 35 und 3 g LM11)werden in einem 1 000-ml-Messkolben (5.5) gelst. Mit Wasser wird bis zur Mar
35、ke aufgefllt und durchmischt. Die Reinigungslsung kann 1 Jahr aufbewahrt werden, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wird. 4.2.2 Regenerationslsung Salzsure mit einer Konzentration c(HCl) = 0,1 mol/l wird verwendet. Die Regenerationslsung kann 1 Jahr aufbewahrt werden, wenn sie bei Raumtemperatur g
36、elagert wird. 4.2.3 Starke Regenerationslsung 30 g Salpetersure (HNO3) mit einem Massenanteil von ungefhr 69 %, 30 g Salzsure (HCl) mit einem Massenanteil von ungefhr 37 %, 30 g Natriumfluorid (NaF) und 1 g Triton X100 werden in einem 1 000-ml-Messkolben (5.5) gelst. Mit Wasser wird bis zur Marke au
37、fgefllt und durchmischt. Die starke Regenerationslsung kann ein Jahr aufbewahrt werden, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wird. 5 Gerte bliche Laborgerte und insbesondere die folgenden: 5.1 Analysenwaage, mit der auf 1 mg gewogen werden kann. 5.2 Mikropipette (positive Verdrngung), Fassungsvermge
38、n 15 l und 20 l. 5.3 Wasserbad, mit dem Temperaturen von (38 1) C und (40 1) C aufrechterhalten werden knnen. 1) Siehe Funote 1) auf Seite 4. EN ISO 14637:2006 (D) 6 5.4 Differenzial-pH-Messgert, blicherweise entsprechend der Darstellung im Anhang A funktionierend. Der Aufbau und die Bestandteile dr
39、fen abweichen. Das Differenzial-pH-Messgert besteht aus Peristaltikpumpen fr die Flssigkeitszirkulation, einer Misch-kammer, zwei Glaskapillar-Durchflusselektroden (EL1 und EL2) und einem elektronischen Messsystem. 5.5 Messkolben mit Markierung, mit einem Fassungsvermgen von 1 000 ml. 6 Probenahme E
40、s ist wichtig, dass das Laboratorium eine Probe erhlt, die tatschlich reprsentativ ist und whrend des Transportes oder der Lagerung nicht beschdigt oder verndert wurde. Die Probenahme ist kein Bestandteil des in dieser Internationalen Norm festgelegten Verfahrens. Ein geeig-netes Probenahmeverfahren
41、 ist in ISO 707 angegeben. 7 Vorbereitung der Untersuchungsprobe Die Untersuchungsprobe wird in einem auf 38 C eingestellten Wasserbad (5.3) whrend der Durchmischung auf diese Temperatur erwrmt. Unmittelbar vor der Vorbereitung der Untersuchungsmenge wird auf 20 C abgekhlt. 8 Durchfhrung 8.1 Allgeme
42、ines Da verschiedene Ausfhrungen von Differenzial-pH-Messgerten (5.4) erhltlich sind, die sich in Konstruktion und Handhabung unterscheiden, sollte die Bedienungsperson grndlich die Betriebsanleitung des Herstellers fr die Einrichtung, Kalibrierung und Bedienung des Gertes befolgen. Das Gert wird ei
43、ngeschaltet und die Stabilisierung der Betriebsbedingungen abgewartet. Falls die Zeit zwischen zwei aufeinander folgenden Messungen 5 min oder mehr betrgt, ist die Pufferlsung (4.1.1) in der Mischkammer des Gertes zu erneuern. 8.2 Blindbestimmung Die Glaskapillar-Durchflusselektroden, EL1 und EL2, d
44、es Differenzial-pH-Messgertes (5.4) werden mit Pufferlsung (4.1.1) gefllt. Der konstante Differenzial-pH-Wert (D1) zwischen den Elektroden wird gemessen. Die Differenz zwischen den beiden Elektroden muss innerhalb der Grenzen von 150 mpH-(MillipH)-Einheiten liegen. Eine Mikropipette (5.2) wird verwe
45、ndet, um 15 l Urease-Enzym-Lsung (4.1.2) in die Mischkammer des Gertes zu geben und durchzumischen. Nur die Glaskapillar-Durchflusselektrode EL2 wird mit der Puffer/Enzym-Mischung gefllt. Der konstante Differenzial-pH-Wert (D2) wird nochmals zwischen den beiden Elektroden gemessen. Die pH-nderung fr
46、 die Blindbestimmung, H0, errechnet sich nach der folgenden Gleichung: H0= D2 D1 EN ISO 14637:2006 (D) 7 Dabei ist H0die Differenz der pH-Einheiten zwischen den zwei konstanten Differenzial-pH-Messungen, D1und D2, fr die Blindbestimmung; D1der Zahlenwert des Differenzial-pH-Wertes zwischen den Elekt
47、roden, wenn beide mit der Puffer-lsung gefllt sind; D2der Zahlenwert des Differenzial-pH-Wertes zwischen den Elektroden, wenn eine mit der Puffer-lsung und die andere mit der Puffer/Enzym-Mischung gefllt ist. Die Differenz, H0, zwischen den zwei Elektroden muss 3 mpH-Einheiten betragen, whrend die D
48、ifferenz zwischen den beiden aufeinander folgenden Messungen 0,5 mpH-Einheiten ergeben muss. Falls diese Ergebnisse nicht erreicht werden, ist die Pufferlsung zu prfen und das oben genannte Verfahren zu wiederholen. Wenn die Ergebnisse immer noch nicht die Anforderung(en) erfllen, dann sind die Elek
49、-troden zu reinigen (siehe 8.8) und die oben genannte Blindbestimmung ist zu wiederholen. 8.3 Kalibrierung 8.3.1 Durchfhrung Eine Mikropipette (5.2) wird verwendet, um 20 l Harnstoff-Standardlsung (4.1.3) in die Mischkammer des pH-Messgertes zu einem Gesamtvolumen von 1 000 l (ein Volumenverhltnis der Harnstoff-Standard-lsung
