1、Mrz 2011DEUTSCHE NORM Normenausschuss Medizin (NAMed) im DINPreisgruppe 9DIN Deutsches Institut fr Normung e. V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.10!$lm/“1737412www.din.deDDIN 58943-5Alleinv
2、erkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 13 SeitenMedizinische Mikrobiologie Tuberkulosediagnostik Teil 5: Molekularbiologische Identifizierung und Differenzierung von Tuberkulosebakterien; Text Deutsch und Englisch Medical microbiology Diagnosis of tuberculos
3、is Part 5: MolecularbiologicaText in German and English Microbiologie mdicale Diagnostic de tuberculose Partie 5: Identification molecularbiologique et la diffrenciation des bacilles tuberculeux; Texte en allemand et anglaisDIN 58943-5:2011-03 Inhalt Seite Contents Page Vorwort 3 Foreword 3 1 Anwend
4、ungsbereich 6 1 Scope6 2 Normative Verweisungen. 6 2 Normative references .6 3 Begriffe 6 3 Terms and definitions.6 4 Abkrzungen. 7 4 Abbreviations 7 5 Anforderungen an die biologische Sicherheit 7 5 Requirements for biological safety .7 6 Voraussetzungen fr die Differenzie-rung von Tuberkulosebakte
5、rien 7 6 Pre-requisites for the differentiation of tubercle bacilli .7 7 Referenzmethoden . 8 7 Reference methods.8 7.1 Allgemeines. 8 7.1 General .8 7.2 SNP-Analyse des gyrB-Gens. 8 7.2 SNP analysis of the gyrB gen 8 7.2.1 Qualittsbeurteilung der Sequenzierung . 9 7.2.1 Quality assessment of sequen
6、cing.9 7.2.2 Grenzen der gyrB-SNP-Analyse 10 7.2.2 Limits of the gyrB SNP analysis10 7.3 Nachweis der RD1-Deletion bei M. bovis BCG 10 7.3 Detection of the RD1 deletion in the case of M. bovis BCG .10 8 Qualittskontrolle . 11 8 Quality control.11 8.1 Interne Qualittskontrolle 11 8.1 Internal quality
7、 control .11 8.2 Externe Qualittskontrolle. 11 8.2 External quality control 11 Literaturhinweise 12 Bibliography.12 2 DIN 58943-5:2011-03 Vorwort Foreword Die Norm wurde vom Arbeitsausschuss NA 063-05-03 AA Tuberkulose- und Mykobakteriendiagnostik“ des Normenausschusses Medizin im DIN Deutsches Inst
8、itut fr Normung e. V. in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Mykobakterien (AKM) erarbeitet. Der AKM ist ein Expertengremium aus dem deutsch-sprachigen Raum, das u. a. Studien zur mykobak-teriologischen Diagnostik koordiniert. This standard has been prepared by Arbeitsaus-schuss (Working Committee)
9、NA 063-05-03 AA “Tuberkulose- und Mykobakteriendiagnostik” (Diag-nosis of Tuberculosis and Mycobacteria) of Normen-ausschuss Medizin (NAMed) (Medical Standards Committee) in the DIN Deutsches Institut fr Nor-mung e. V. (German Institute for Standardization) in cooperation with Arbeitskreis Mykobakte
10、rien (AKM) (Working Group on Mycobacteria). The AKM is a panel of experts based in the German-speaking area which, among other things, coordinates studies regarding mycobacteriological diagnostics. DIN 58943 Medizinische Mikrobiologie Tuberku-losediagnostik besteht aus (Beibltter werden nicht aufgef
11、hrt): DIN 58943, Medical Microbiology Diagnosis of tuberculosis consists of (supplements are not listed): Teil 3: Kulturelle Methoden zum Nachweis von Mykobakterien Part 3: Detection of mycobacteria by culture methods Teil 4: Primrproben zur Tuberkulose- und Mykobakteriosediagnostik, qualitative und
12、 quan-titative Anforderungen, Gewinnung, Transport und Aufbewahrung Part 4: Primary samples for the diagnostics of tuberculosis and mycobacteria Qualitative and quantitative requirements, extraction, trans-port and storage Teil 5: Molekularbiologische Identifizierung und Differenzierung von Tuberkul
13、osebakterien Part 5: Molecular identification and differentia-tion of tubercle bacilli Teil 7: Modifiziertes Lwenstein-Jensen-Kultur-medium zur Anzchtung von Mykobakterien Part 7: Modified Lwenstein-Jensen medium for the growth of mycobacteria Teil 8: Empfindlichkeitsprfung von Tuberku-losebakterien
14、 gegen Chemotherapeutika Part 8: Methods for the determination of suscep-tibility of tubercle bacilli to chemotherapeutic agents Teil 9: Phnotypische Differenzierung von Tuberkulosebakterien Part 9: Phenotypic differentiation of tubercle bacilli Teil 32: Mikroskopische Methoden zum Nach-weis von Myk
15、obakterien Part 32: Detection of mycobacteria by micro-scopic methods Teil 40: Bewertungskriterien fr kulturelle Schnell-verfahren zum Nachweis von Mykobakterien Part 40: Evaluation criteria for fast culture pro-cedures for the detection of mycobacteria 3 DIN 58943-5:2011-03 Einleitung Introduction
16、Das klinische Bild einer Tuberkulose kann von meh-reren, genetisch eng verwandten Mykobakterien-Arten hervorgerufen werden. Sie werden zu den Tuberkulosebakterien (Mycobacterium tuberculosis-Komplex) zusammengefasst. Zum Zeitpunkt der Er-stellung dieser Norm zhlten folgende Arten zu den Tuberkulose-
17、bakterien. M. tuberculosis, M. africa-num, M. bovis subsp. bovis (Synonym: M. bovis), M. bovis subsp. caprae (Synonym: M. caprae), M. microti, M. pinnipedii. M. canettii“ wird als Vari-ante von M. tuberculosis angesehen. M. tuberculosis kommt weltweit vor und ist in Europa der am hufigs-ten isoliert
18、e Erreger der Tuberkulose. M. africanum ist endemisch auf Afrika beschrnkt und kann dort zu einem erheblichen Prozentsatz von TB-Patienten isoliert werden. Infektionen mit M. bovis (beide Sub-spezies) werden im deutschsprachigen Raum selten beobachtet (ca. 1% bis 2 % der Tuberkulose-Flle 11). ber In
19、fektionen mit M. microti oder M. pinni-pedii wurde bislang nur in Einzelfllen berichtet. The clinical picture of tuberculosis can be caused by several genetically closely related mycobacteria spe-cies. These species are summarized as tubercle bacilli (Mycobacterium tuberculosis complex). At the time
20、 of the preparation of this standard, the following species were regarded as tubercle bacilli: M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis subsp. bovis (synonym: M. bovis), M. bovis subsp. caprae (synonym: M. caprae), M. microti, M. pinnipedii. “M. canettii” is regarded as a variant of M. tuberculosis.
21、M. tuberculosis occurs worldwide and is the tuberculosis pathogen isolated most often in Europe. M. africanum is endemically limited to Africa and a high percentage can be isolated there from TB patients. Infections with M. bovis (both subspecies) are rarely encountered in the German-speaking region
22、 (approximately 1 % to 2 % of the tuberculosis cases) 11). Infections with M. microti or M. pinnipedii have, so far, only been reported in individual cases. Whrend M. tuberculosis und M. africanum fast aus-schlielich Infektionen beim Menschen verursachen, werden die anderen Arten der Tuberkulosebakt
23、erien auch bei Tieren gefunden. Die M. bovis BCG Stmme sind attenuierte M. bovis Stmme und wer-den zur Impfung eingesetzt. Beim Blasenkarzinom dienen sie als Immuntherapeutikum, weshalb sie aus dem Urin entsprechender Patienten isoliert werden knnen. Ihre Pathogenitt ist gering. While M. tuberculosi
24、s and M. africanum cause infec-tions almost exclusively in humans, the other species of tubercle bacilli are also found in animals. The M. bovis BCG type strains are attenuated M. bovis strains and are used for vaccinations. They are also used as an immunotherapeutic agent for the treatment of bladd
25、er cancer, which is why they can be isolated from the urine of affected patients. Their pathogenicity is low. Die Regeln fr die Beschreibung einer Bakterienart werden vom International Committee on Systematics of Prokaryotes festgelegt und sehen folgende Krite-rien vor 1, 2: The rules for describing
26、 a bacterial species are specified by the International Committee on Sys-tematics of Prokaryotes and include the following cri-teria 1, 2: 1) Genetische Divergenz: mindestens 30 % gene-tische Differenz in DNA-DNA-Hybridisierungs- Versuchen oder mindestens 3 % Sequenzunter-schied im kompletten 16S-rR
27、NA-Gen von allen anderen Arten derselben Gattung. 1) genetic divergence: a genetic difference of at least 30 % in DNA-DNA hybridization assays or a sequence difference of at least 3 % in the complete 16S-rRNA gene when compared to all the other species of the same genus. 2) Phnotypische Divergenz: m
28、indestens ein ph-notypisches Merkmal muss eine eindeutige Differenzierung gegenber den anderen Arten derselben Gattung ermglichen. 2) phenotypic divergence: at least one phenotypic characteristic shall enable an unambiguous differentiation with regard to the other species of the same genus. Diese Kr
29、iterien wurden bei den Tuberkulosebakte-rien verlassen. Das 16S-rRNA-Gen ist bei allen Arten der Tuberkulosebakterien identisch. DNA-DNA-Hybridisierungsversuche wurden bei den Art-Beschreibungen unterlassen. Phnotypische Metho-den ermglichen keine eindeutige Differenzierung aller Arten. Die phnotypi
30、schen Beschreibungen der neueren Taxa M. bovis subsp. caprae (Synonym M. caprae), M. microti und M. pinnipedii basierten zum Teil nur auf wenigen Isolaten. These criteria have been abandoned in the case of tubercle bacilli. The 16S-rRNA gene is identical in all tubercle bacilli species. The DNA-DNA
31、hybridization tests were omitted in the descriptions of the species. Phenotypic methods do not enable an unambiguous differentiation of all species. The phenotypic descrip-tions of the more recent taxa M. bovis subsp. caprae (synonym M. caprae), M. microti and M. pinnipedii were partly based on only
32、 few isolates. 4 DIN 58943-5:2011-03 Die Taxonomie der Tuberkulosebakterien folgt somit eigenen, nicht standardisierten und zum Teil noch unklaren Regeln. Die Systematik befindet sich in rascher Entwicklung. Die vorliegende Norm kann in die bestehenden Unschrfen keine Klarheit bringen, noch kann sie
33、 Einfluss auf die Entwicklung der Sys-tematik der Tuberkulosebakterien nehmen. Sie soll aber standardisieren, wie die fr die Humanmedizin bedeutsamsten Arten der Tuberkulosebakterien mit genetischen Tests zu identifizieren und gegeneinan-der abzugrenzen sind. Zu diesen Arten gehrten zur Zeit der Ers
34、tellung dieser Norm M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis und M. microti mit ihren jeweiligen Unterarten und Varianten. Thus, the taxonomy of the tubercle bacilli follows its own, non-standardized and partly unclear rules. The development of the systematics is fast. This standard is not able to cl
35、arify the existing uncertainties, nor can it influence the development of the systematics of the tubercle bacilli. It is intended, however, to standardize the application of genetic tests in order to identify and differentiate between the tubercle bacilli species most significant in human medicine.
36、At the time of the preparation of this standard these species included M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis and M. microti with their respective subspecies and variants. Wegen ihrer genetischen Nhe gibt es kaum eine molekularbiologische Methode, die geeignet wre, alle Arten der Tuberkulosebakteri
37、en gleichzeitig zu differenzieren. Die SNP (single nucleotide poly-morphism) Analyse des gyrB Gens ermglicht es, die humanmedizinisch bedeutsamsten Arten zu erkennen 3. Die SNPs knnen mittels Sequenz-, RFLP (restriction fragment length polymorphism)-Analyse oder Hybridisierungs-Assays nachgewiesen w
38、erden. Das gyrB-Gen der M. bovis BCG-Stmme ist identisch mit dem anderer M. bovis bovis Stmme. Zur Abgrenzung eines Impfstamms gegen virulente M. bovis bovis Stmme eignet sich der Nachweis der RD1 (region of difference 1), die bei allen Arten der Tuberkulosebakterien vorhanden ist und nur M. bovis B
39、CG-Stmmen fehlt. Ein PCR ba-sierter Nachweis der RD1 wurde in einer publizierten Studie validiert 4. In der vorliegenden Norm werden die genannten Methoden zu einem Algorithmus kombiniert. Es drfen auch andere Methoden ange-wendet werden, sofern sie nachweislich zu gleich-wertigen Ergebnissen fhren
40、(z. B. Restriktions-analyse oder Hybridisierung zur gyrB-Mutations-analyse; Deletionsanalysen der RD-Regionen). Due to the genetic similarity of these species, there is hardly any molecular-biological method suitable to simultaneously differentiate all tubercle bacilli spe-cies. The SNP (single nucl
41、eotide polymorphism) analysis of the gyrB gene enables the detection of the species most significant in human medicine 3. The SNPs can be detected by means of sequence analysis, RFLP (restriction fragment length polymor-phism) analysis or hybridization assays. The gyrB gene of the M. bovis BCG strai
42、ns is identical to that of other M. bovis bovis strains. For the purposes of differentiating between a vaccine strain and virulent M. bovis bovis strains, the detection of the RD1 (region of difference 1) which is existent in all tubercle bacilli species except for the M. bovis BCG type strains is s
43、uitable. A PCR-based detection of the RD1 has been validated in a published study 4. In this standard, the methods mentioned are combined to form an algorithm. Other methods may be applied, provided they can be shown to lead to equivalent results (e.g. restriction analysis or hybridization for gyrB
44、mutation analysis; deletion analyses of the RD regions). 5 DIN 58943-5:2011-03 1 Anwendungsbereich 1 Scope Diese Norm gilt fr die molekularbiologische Diffe-renzierung von Kulturen von Tuberkulosebakterien (M. tuberculosis-Komplex). Sie gilt nicht fr die Anwendung auf Direktmaterial. This standard a
45、pplies to the molecular-biological differentiation of cultures of tubercle bacilli (M. tuber-culosis complex). It does not cover the application on direct material. 2 Normative Verweisungen 2 Normative references Die folgenden zitierten Dokumente sind fr die An-wendung dieses Dokuments erforderlich.
46、 Bei datier-ten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Doku-ments (einschlielich aller nderungen). The following referenced documents are indispen-sable for the application of this document. For dated referen
47、ces, only the edition cited applies. For un-dated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies. DIN 58943-9, Medizinische Mikrobiologie Tuber-kulosediagnostik Teil 9: Phnotypische Differen-zierung von Tuberkulosebakterien; Text Deutsch und Englisch DIN
48、 58943-9, Medical Microbiology Diagnosis of tuberculosis Part 9: Phenotypic differentiation of tubercle bacilli; Text in German and English DIN 58967-60, Serologische und molekularbiolo-gische Diagnostik von Infektions- und Immunkrank-heiten Teil 60: Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Begriffe, allgeme
49、ine methodenspezifische Anfor-derungen DIN 58967-60, Diagnostics of infectious diseases and diseases of the immune system in serology and molecular biology Part 60: Polymerase chain reaction (PCR) Terminology, general method-specific requirements DIN 58969-62, Medizinische Mikrobiologie Sero-logische und molekularbiologische Diagnostik von Infektionskrankheiten Teil 62: Polymerase-Kettenraktion (PCR) Spezielle Anforderungen fr den Nach
