1、ICS 65.020B39DB 13河 北 省 地 方 标准DB13/T 958=2008金针菇菌种2008-05-19发布2008-06-03实施箩可北省质量技术业轰督局 发布DB 13/T 958-2008.山.舀.月U青本标准的附录A为规范性附录。本标准由河北省农业厅提出。本标准起草单位:河北省农业环境保护监测站、河北师范大学生命科学学院。本标准主要起草人:安沫平、王立安、唐铁朝、通占元、周玉环。DB13/T 958-2008金针菇菌种1范日本标准规定了金针菇(Flammulina velutipes)菌种的质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包装、贮运等。本标准适用于小火菇属(F
2、lammulina)的金针菇(Flammulina velutipes)黄色及白色两个品种的菌种生产、流通和使用。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 191包装储运图示标志(MOD 1) (eqv ISO 780:1997)GB/T 4789.28食品卫生徽生物学检验 染色法、培养基和试剂NY/T 528-2002食用菌菌种生产技术规程3术语和定义下列术语和
3、定义适用于本标准。3.1母种stock culture经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管(18 mm X18 mm或20 mm X 20 mm)为培养容器和使用单位，也称一级种、试管种。3.2原种pre-culture spawn由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。也称二级种，常以玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶或聚丙烯塑料袋为容器。3.3裁培种spawn由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。常以玻璃瓶或塑料瓶或塑料袋为容器，也称三级种。3.4拮抗现象antagonism具有不同遗传基因的菌落间相互抑制形成不同形式线形边缘的现象。3.5角变5。改。r因菌丝
4、体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。3乃抑翻级inhibitory line食用菌菌种在生产过程中受高温等不良环境影响，培养物出现的圈状发黄、发暗或菌丝变稀弱的DB 13/T 958-2008现象。3.7无棉塑料盖plastic St叩可代替棉塞，带有某种高分子或纤维材料可满足滤菌和透气要求的塑料盖。3.8生物学效率 biological efficiency单位质量培养料的风干物质与所培养产生出的子实体质量(鲜重)之间的比率。其计算公式为:子实体鲜重(kg) /培养料风干质量(吨)X 100%03.9种性characters of variety食用
5、菌品种对温度、湿度、酸碱度、光线和氧气的要求，以及抗逆性、丰产性、出菇潮数、栽培周期等农艺性状及商品性状。3.10同工醉isoenzyme催化相同生化反应，而结构及理化性质不同的酶分子。通过凝胶电泳使同工酶分离成迁移率不同的区带，经生物化学染色后显示出的同工酶谱，可对生物品种进行酶分子水平的鉴别或鉴定。3.11锁状联合clamp connection担子菌双核菌丝细胞进行有丝分裂时出现的特殊结构，多发生在菌丝的顶端。4质I要求4.1母种4.1.，容器规格符合NY/T 528-2002中4.7.1.1规定。4.1.2感官要求符合表1规定。表1母种感官要求项目要求容器完整、无损棉塞或无棉塑料盖干操
6、、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基灌入量为试管总容积的四分之一至五分之一培养基斜面长度顶端距棉塞40 mm-50 mm菌种外观菌丝生长量长满斜面菌丝体特征洁白、浓密、旺健、细棉絮状、粉抱子少菌丝体表面均匀、舒展、平整、无角变菌丝分泌物无菌落边缘整齐杂菌菌落无斜面背面外观培养基不干缩，颜色均匀、无不正常的暗斑、色素4.1.3接种I接种块大小为(3-5) mmX (35) mm04.1.4菌丝生长速度DB13/T 958-2008在PDA培养基上，培养温度为20cC,25条件下，8d-12d长满斜面。4.1.5母种遗传性状供种单位所供母种的遗传特性应与该品种的遗传特性相一致，可采用醋酶(
7、Est)同工酶技术鉴定。4.1.6曹丝锁状联合及双核特征供种单位所供母种需经显微镜或荧光显微镜确定母种菌丝细胞具锁状联合或双核特征后，方可用于扩大繁殖或出售。4.1.7母种栽培性状供种单位所供母种经出菇试验确证农艺性状和商品性状等种性特征合格后，方可用于扩大繁殖或出售。正常条件下，在棉籽壳栽培料上的定植时间一般为2d-3d;第一潮菇生物学效率不低于50%4.2原种4.2.1容器规格符合NYIT 528-2002中4.7.1.2规定。4.2.2感官要求符合表2规定。表2原种感官要求项目要求容器完整、无损棉塞或无棉塑料盖干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基上表面距瓶(袋)口的距离50
8、mm士5 mm菌种外观菌丝生长量长满容器菌丝体特征洁白浓密，生长旺健培养物表面菌丝体生长均匀，无角变，无高温抑制线培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁，无干缩培养物表面分泌物无，允许有少量无色或浅黄色水珠杂菌菌落无拮抗现象无子实体原基无气味有金针菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异味4.2.3接种f每支母种接原种数为4-6瓶(袋)，接种物大小为)“12 mm X 15 mm o4.2.4菌丝生长速度在适宜的培养基上，在温度为20-25条件下，25 d-30 d长满容器。4.3栽培种4.3.1容器规格符合NY/T 528-2002中4.7.1.3规定。4.3.2感官要求符合表3规定。D813/T 958
9、-2008表3栽培种感官要求项目要求容器完整、无损棉塞或无棉塑料盖干燥、洁挣、松紧适度，能满足透气和滤菌要求培养基上表面距瓶(袋)口的距离50 mm士5 mm菌丝生长量长满容器菌丝体特征洁白浓密，生长旺健，饱满培养物表面菌丝体生长均匀，色泽一致，无角变，无高温抑制线培养基及菌丝体紧贴瓶(袋)壁，无干缩培养物表面分泌物无，允许有少量无色或浅黄色水珠杂菌菌落无拮抗现象无子实体原基允许少量，出现原基总量X596气味有金针菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异味4.3.3接种f每瓶原种接栽培种数为2040瓶(袋);接种物大小)15 mmX20 mmo4.3.4菌丝生长速度在温度为209C-25条件下，在
10、谷粒培养基上菌丝长满瓶应(1512) d，长满袋应(2012) d;在其他培养基上长满瓶应20 d-25 d，长满袋应30 d-40 do4.3.5种谏应从具有相应供种资质的供种单位引种。栽培种只能用于栽培，不可再次扩大繁殖菌种。5抽样5.1抽样应具有代表性。5.2母种按品种、培养条件、接种时间分批编号;原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。5.3母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批接种量的10%. 5%、 1%。但每批抽样数量不得少于10支(瓶、袋);超过100支(瓶、袋)的，可进行两级抽样。6检验方法6.1犷官检验按表4逐项进行。表4感官要求检验方法检验
11、项目检验方法检验项目检验方法容器肉眼观察菌丝长势肉眼观察棉塞、无棉塑料盖肉眼观察培养基上表面距瓶(袋)口的距离肉眼观察母种培养基灌入量肉眼观察菌种外观各项(杂菌菌落除外)肉眼观察母种斜面长度肉眼观察杂菌菌落肉眼观察，必要时用5x放大镜观察母种斜面背面外观肉眼观察气味鼻嗅6.2徽生物学检验6.2.1细菌检验取少量菌种培养物，按无菌操作接种于GB/1 4789.28中4.8规定的营养肉汤培养液中，25一DB 1 3/T 958-200828振荡培养1 d-2 d，观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染;培养基澄清，为无细菌污染。6.22.菌检验取少盘菌种培养物，按无菌操作接种于PDA培养基(
12、见附录A中A.1.1)中，25-28培养3 d-4 d，出现异常的非金针菇菌丝形态菌落的，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。6.3母种趁传性状检验(Est同工醉鉴定)取PDA加富液体培养基中培养7d左右的菌丝球，按13:0.5的比例混合菌丝(g) , 0.1 mol/L磷酸缓冲液mL)和石英砂(g),研磨成匀浆;台式离心机10 000 r/min离心5 min，取上清液，按5:1:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%澳酚蓝溶液作为电泳样品。4下冷藏备用。采用聚丙烯酞胺凝胶电泳，用pH 6.8的Tris-HCl 4%浓缩胶;pH 8.9的Tris-HCI缓冲液配制7.5%的分离
13、胶;用pH 8.3的Tris一甘氨酸作电极缓冲液。上样量200 5g，浓缩胶电压80 V ;分离胶电压120 V，当样品到达分离胶下边缘时，停止电泳。100 mg固蓝B盐，溶于150 mL磷酸缓冲液(0.1 moUL, pH6.5)中，过滤待用。使用前称取50 mg乙酸一1-蔡醋、50 mg乙酸一2-蔡醋，溶于3 mL丙酮中，然后逐滴倒人上述滤液中，边加边搅使其均匀混合即可染色，显现酶谱。6.4母种苗丝锁状联合及双核的检验从试管中挑取菌丝少许，置于洁净的载玻片上做成水封片，显微镜下(400X)镜检，可见明显的锁状联合。从试管中挑取菌丝少许，置于洁净的载玻片上。先将70%酒精滴加于菌丝上固定2-
14、3 min,蒸馏水稍洗再滴加现配染液(州7.0的磷酸缓冲液配制的0.01%丫吮橙)染色20 mind蒸馏水清洗多余染液后做成水封片，荧光显微镜紫外光下(400X)观察可见到呈绿色荧光的双核。6.5菌丝生长速度检验6.5.1母种PDA培养基，20CC -25条件下培养，计算长满所需天数。6.5.2原种和栽培种 按附录A中A.2.1, A.2.2 , A.2.3 , A.2.4规定的配方任选其一，在20CC-25条件下.记录长满所需天数。表5母种农艺性状和商品性状检验记录检验项目检验结果检验项目检验结果母种长满所需时间/d总产傀原种长满所需时间/d平均单产几9栽培种满袋(瓶)所需时间/d生物学效率
15、/(%)第一湘菇产量戈菇形、色泽、质地第一潮菇生物学效率/(%)菇盖直径、菌柄长b/mm6.6母种农艺性状和商品性状检验将被检母种制成原种，采用附录A.3规定的培养基配方，制作菌袋。按常规方法发菌、出菇，根据表5所列项目，做好栽培记录。6.7留样各级菌种均须留样备查，留样的数量应每个批号母种3 -5支，原种、栽培种3-5瓶(袋)，于49C-6下贮存。母种5个月(3个月转管1次)，原种4个月，栽培种2个月。DB13/T 958-20087检验规则判定规则按质量要求进行。检验项目全部符合质量要求时，为合格菌种;其中与菌种纯度(带细菌、霉菌)、菌种外观、遗传稳定性(锁状联合或双核或Est图谱)、产量
16、性状相关的指标，任何一项不符合要求，均为不合格菌种。8标金、标志、包装、运输、贮存8.1标签、标志8.1.1产品标签每支(瓶、袋)菌种必须贴有清晰注明以下要素的标签:a)产品名称(如:金针菇母种);b)品种名称(如:金F-21);c)生产单位(XX菌种厂);d)接种日期(如:2007.X X.X X);e)执行标准。8.1.2包装标签每箱菌种必须贴有清晰注明以下要素的包装标签:a)产品名称、品种名称;b)厂名、厂址、联系电话;c)出厂日期;d)保质期、贮存条件;e)数量;f)执行标准。8.1.3包装储运图示按GB 191规定，应注明以下图示标志:每箱菌种必须贴有清晰注明以下要素的包装标签:a)
17、小心轻放标志;b)防水、防潮、防冻标志;c)防晒、防高温标志;d)防止倒置标志;e)防止重压标志。8.2包装8.2.1母种外包装采用木盒或有足够强度的纸材制作的纸箱，内部用棉花、碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。8.2.2原种、栽培种:外包装采用有足够强度的纸材制作的纸箱，内部用棉花、碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。纸箱上部和底部用8 cm宽的胶带封口，并用打包带捆扎两道，箱内附产品合格和使用说明(包括菌种种性、培养基配方及适用范围等)。8.3运输8.3.1不得与有毒物品混装。8.3.2气温达30以上时，需用2cC一 20的冷藏车运输。8.3.3运翰中必须有防震、防晒、防尘、防雨
18、淋、防冻、防杂菌污染的措施。8.4贮存8.4.1母种在5土1冰箱中贮存，贮存期不超过90天。DB13/T 958-20088.4.2原种应尽快使用，在温度不超过2590、清洁、干燥通风(空气相对湿度50%-70%)、避光的室内存放谷粒种不超过7d，其余培养基的的原种不超过14天。在5cC11下贮存，贮存期不超过45 d8.4.3栽培种应尽快使用，在温度不超过25t.清洁、通风、干燥(相对湿度50%-70%)、避光的室内存放谷粒种不超过7d，其余培养基的栽培种不超过20 d。在1-6下贮存时，贮存期不超过45 daDB13/T 958-2008附录A(规范性附录)菌种常用培养基及其配方A.1常用
19、母种培养基及其配方A.1.1 PDA培养基(1 000 mL)马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 goA.1.2 CPDA培养基1 000 mL)马铃薯200 g,葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5 g，琼脂20 goA.2常用原种和栽培种培养墓及其配方A.2.1谷粒培养基小麦、谷子、玉米或高粱98%，石膏2%，含水量52%-55%A.2.2棉籽壳麦数培养墓棉籽壳84%，麦鼓巧%，石膏1%，含水量60%士2%A.2.3棉籽壳培养墓棉籽壳100%，含水量60%士2%A.2.4木屑培养基阔叶树木屑79%，麦鼓20%，石膏1%，含水量55%士2%A.3常用栽培性状检验用培养墓棉籽壳98%，石灰2%.含水量印%士2%
