1、 ICS 67.050 B 31 天 津 市 地 方 标 准 DB12 DB12/T 648 2016 黄瓜 品种 纯度 SSR 分子标记 检测 方法 Methods of identifying varietal purity of cucumber by using SSR-based markers 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津 市 市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 648 2016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由 天津市 农村工作 委员会 提出 。 本标准起草单位： 天津市农业质量标准与检测技术研
2、究所 、 天津市蔬菜研究中心 。 本标准主要起草人： 兰青阔、张桂华、王惠哲、赵新、王成、崔兴华、朱珠、陈锐、 徐石勇 。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 DB12/T 648 2016 1 黄瓜 品种纯度 SSR 分子标记 检测 方法 1 范围 本标准规定了黄瓜 品种纯度 SSR分子标记 检测 方法的 术语和定义、检测方法 、纯度计算方法 。 本标准适用于黄瓜单交种的纯度 检测 。 2 规范性引用文件 下列文 件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2
3、 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2474 黄瓜品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种纯度 Varieties Purity 品种纯度 指种子在 SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率 表示 ， 以反映 某品种 特征特性 的 一致 性程度。 3.2 聚合酶链式反应 PCR（ Polymerase Chain Reaction） 一种在体外通过酶促反应扩增特异 DNA片段的技术。 3.3 简单重复序列 SSR（ Simple Seq
4、uence Repeat） 由几个核苷酸（ 1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个 bp（一般为 100-200bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 3.4 分子标记 Molecular Marker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生 物在遗传上的差异。 4 原理 DB12/T 648 2016 2 SSR分布于 黄瓜 整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用 PCR技术将多态的 SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行 黄瓜 品种纯度检测 。 5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备
5、 PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（ 3000 V， 400 mA， 400 W）；万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外 -可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅； pH计等。 5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（ Tris）；盐酸 （ HCl， 36%）；十二烷基硫酸钠（ SDS）；氯化钠（ NaCl）；氢氧化钠（ NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（ TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（ 37%）； Taq
6、 DNA聚合酶（含 Mg2+的 10 PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸（ dNTPs）； SSR引物；琼脂糖； Gold View染料 ；实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水 等。 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。 5.3 溶液配制 相关 溶液配制方法见附录 A。 6 方法步骤 6.1 取样 按照 GB/T 3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取 10 g种子， 分别随机取其亲本种子 10粒 。 6.2 单粒种子的 DNA 提取 6.2.1 样品 预处理 在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花， 用自来水 浸湿后均匀 地 撒上种子，再于表面覆盖一层纱布， 置于
7、 光照培养箱中 。培养条件为 16小时 28光照 培养， 8小时 22 暗 培养，待种子长出 子叶 后备用。 也可 采用经验证的、等效的 培养条件 。 6.2.2 DNA 提取 取 单株 幼 苗子叶， 放入 1.5 mL离心管中，在液氮中研碎，放入 1.5 mL离心管中。将 DNA提取液预热到 65 ，每管放入 400 L 混合样品，将离心管置于 65 金属浴或水浴锅中，保温 30 min后取下，向离心管中加入 400 L 24:1氯仿 -异戊醇（ V:V），振荡混匀。 10 000 g离心 10 min。将上清液 200 L 转入另一支 1.5 mL离心管，加入 400 L -20 预冷无水
8、乙醇沉淀 DNA。 10 000 g离心 1 min，弃上清液，加入500 L 乙醇 乙酸铵溶液， 6000 g离心 5 min收集沉淀。加入 100 L TE（ pH8.0）溶液溶解 DNA。 用 0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。使用紫 外 -可见成像系统观察 DNA电泳条带的完整性。 6.3 分子标记筛选 DB12/T 648 2016 3 用 35对核心引物 （见附录 B， 部分 引用 NY/T 2474）进行 PCR反应，扩增双亲及送检样品各 10份 DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度 检测 的 SSR分子标记。 6.4 PCR 扩增 6.4.1 反应体
9、系 总体积 20 L，包括 9.2 L超纯水、 2 L含 Mg2+的 10PCR缓冲液、 1.6 L dNTPs（ 2.5 mmol/L）、3.2 L SSR引物（ 10 mol/L）、 2 L Taq DNA聚合酶（ 2.5 U/L）、 2 L DNA（ 3050 ng/L） ，混匀。 6.4.2 反应程序 94 预变性 4 min； 94 变性 15 s， 58 退火 15 s， 72 延伸 30 s，循环 35次； 72 延伸 5 min； 4保存。 6.5 变性 聚丙烯酰氨凝胶电泳 按照附录 C规定的方法，进行 4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶 制作 及 电泳检测扩增产物 。 7 纯度计算
10、以筛选出来的 SSR分子标记为引物扩增至少 100份送检样品的 DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下： %100检测样品种子粒数 种子粒数具有本品种特异带型的%纯度 DB12/T 648 2016 4 附录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 DNA提取液 含有 200 mmol/L Tris-HCl（ pH 8.0）， 250 mmol/L NaCl， 25 mmol/L EDTA， 0.5% SDS，经高压蒸汽灭菌后使用。 A.2 引物稀释 按照引物合成单的说明先配制 100 mol/L的储存液，取适量储存液稀释 40倍，配
11、制浓度为 2.5 mmol/L的使用液。 A.3 6 变性上样缓冲液 去离子甲酰胺 49 mL， 0.5 mol/L的 EDTA溶液（ pH 8.0） 1mL，溴酚蓝 0.125 g，二甲苯青 0.125 g。 A.4 10 电泳缓冲液 Tris 108g，硼酸 55 g， 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0）溶液 37 mL，定容至 1000 mL。 A.5 40%丙烯胺胶 丙烯酰胺 190 g，甲叉双丙烯酰胺 10 g，定容至 500 mL。 A.6 4.5%丙烯胺胶 尿素 450 g， 10 电泳缓冲液 100 mL， 40%丙烯酰胺胶 112.5 mL，定容至 1000 mL
12、。 A.7 1%亲和硅烷 20 L亲和硅烷， 20 L冰醋酸，加无水乙醇至 2 mL。现用现配。 A.8 2%剥离硅烷 1 mL剥离硅烷， 49 mL三氯甲烷。 A.9 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于 1 mL超纯水中。现用现配。 A.10 固定液 DB12/T 648 2016 5 200 mL冰醋酸，定容 至 2000 mL。 A.11 染色液 4 g硝酸银，定容至 2000 mL。 A.12 显影液 2000 mL蒸馏水中加入 40 g氢氧化钠和 10 mL甲醛。 DB12/T 648 2016 6 附 录 B （规范性附录） 41 对核心引物 序号 名称 序列 (5 -3 )
13、01 SSRTJ001 F:TCGCCCACGTCCTCTATATC R:GCTAATGAAGGGGGAGGAGA 02 SSRTJ002 F:GCGTTAAAATTCCCAACGG R:GGAGAGAAATTGGAATTCGGCAG 03 SSRTJ003 F:GGGTCTAATATTTGGGGATGG R:GGTTGTTCTTGTGGAATGTG 04 SSRTJ004 F:TACACCTCTGCGAAGCACC R:GTTTCGCACTCACTCTTTACCG 05 SSRTJ005 F:TTTAATGGCGTCGAAATGGT R:GTTCCATTAACGAGCTTCCC 06 SSR
14、TJ006 F:ACTATCATTCTTTATCCCCATCAT R:ATACAAAAATGCACAT 07 SSR00262 F:CCGTTGGTCTTGGACTCTCA R:TGTAAAAGTGATCAGGAGGGTCT 08 SSR16695 F:CACAATCCCACGAAGAACAA R:TGCAATTATGGCAAATCAAAA 09 SSR10839 F:TTGAATTCCTCTGCCCAATC R:TGGAATTTTGTTAGGGGGAA 10 SSR05723 F:TGGCTTTTCTGTCACGTCC R:TCCATGGTACAACAAGAATCACA 11 SSR1792
15、2 F:CATTCTAGGTCAATGAATCGCA R:GCAAAGTTGCCACATTGAAG 12 SSR03070 F:GCTAACACTACCCGCTGCTT R:AACAGAAAGAGAATCGGGGG 13 SSR05748 F:TGTGGCCTGTGCTAAAATGA R:TTTGGAAAAGCTAAAGCCCA 14 SSR23220 F:GTTTGCATGAAAATGGGGAT R:CATCATCTTCTTGGTGGTTCC 15 SSR20079 F:ATCAGCATGTGGTGTGGTGT R:GGGATATGCGTTTGCATTTA 16 SSR10518 F:TCT
16、AATTCGCTCCGGATGAT R:TTGCAGCGAACAATCCTGTA 17 SSR04530 F:CCTCTAGACTGAAAAAGAGGGACA R:ATTATTTGGGCCTTTGGGAA 18 SSR07131 F:TTCTCATGCTTCCTACCGCT R:TTCTATTGGAGGGCTGGTTG DB12/T 648 2016 7 序号 名称 序列 (5 -3 ) 19 SSR02771 F: AAGTACACCAGCACTTGGGC R: CACACTCTTATGGCTTTCGTCA 20 SSR06210 F: TTGGAAAAGTCGCCAAACTT R: TCC
17、ATGTCTGCTTTTGATTCC 21 SSR03820 F: AGAGGGCAAATTGGTGAATG R: TCCATCCTGT ATGATTTGAGTTG 22 SSR17406 F: GAGCCATCCATCAGAGAGAGA R: ACCCACAAGCTTCAGAGGTC 23 SSR01012 F: AGGTACGAA AC AACGGCAAT R: TCGCACTCACTCTTTACCGA 24 SSR02771 F: CATAAGCCTTTCAAGCTGGG R: CTGAGGTCTCCTGATGGAGG 25 SSR06210 F: CACACCATTTACGGTTATG
18、GG R: CATTTGGTTCAGAAAGGGGA 26 SSR03820 F: ATCCAAGAGGTTTCCAACGA R: TGGTCAATGAGCTTAGCTTTCTC 27 SSR17406 F: TCAATTCCGATTCCATTTCC R: AATTTGGTCCAACCCAACCT 28 SSR11043 F: GCAGGTCAGCACCTTCAACT R: TCAGGAGGCTTTTTAAGCGA 29 SSR22706 F: GGCAAATTCCACAGAGCTTC R: TACGCCCGATATTCTTCGTC 30 SSR07100 F: TGAAATGCCTCTGCA
19、ATGAC R: TCATGACTAGACACGCCAGC 31 SSR21164 F: TCCAAAAATCGCGACCTAAA R: GTGAGCCGTTGATTTCTCGT 32 SSR20218 F: CTGGTGGGTTTTCTGAAACG R: TCGCCCACGTCCTCTATATC 33 SSR12994 F: AAGTTTATATTACAGTTGCAACAACCA R: TGCACATGTTTAATGGTCCAA 34 SSR16096 F: GCGTGCCCTTCTACTGTTTC R: TCAAGCCGATTTCTCTTCGT 35 SSR31399 F: CCGAGGA
20、TACCCATCTCTGA R: AGAAGAACACCTGGAACAGACA 36 SSR30495 F: ACCAACTTGTGAAAGGGCAT R: CACATGATTCACTTCCTTTCATTT 37 SSR15955 F: TTTGAGCCTTGAGGCAAAGT R: GCAATTCAACGTAATGGGCT 38 SSR19918 F: CACATGACACAAACACAATTCTT R: GAGTCCCCAAAAGCAATTCA 39 SSR14861 F: ATTTCTTCCCCCACCAAAAC R: ATGAATCCTCCTCCCAGAGC DB12/T 648 20
21、16 8 序号 名称 序列 (5 -3 ) 40 SSR03917 F: CCCTGCAGCTCTTCTTTGTC R: TGGTTACAGAAGCAAAAGGGA 41 SSR20286 F: AAACGTCGATCGAGAGAGGA R: AAAGAACCGCCATGTCTTTG DB12/T 648 2016 9 （规范性附录） 制胶过程 C.1 凝胶制作 将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂 1%亲和硅烷，在短板上涂 2%玻璃硅烷。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好，用水平仪调平。取 4.5%丙烯酰胺胶 80 mL，加入 TEMED 80 L和
22、 10%过硫酸铵 400 L，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合 1 h以上。 C.2 预电泳 待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好， 80 W恒功率下预电泳 15 min20 min。 C.3 变性 在 20 L PCR产物中加入 4 L 6 变性上样缓冲液，混匀后，在 PCR仪上运行变性程序： 95 变性 5 min， 4 冷却 10 min。 C.4 电泳 用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质。每个加样孔加入 5 L变性后的 PCR产物。 80W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的 中部。 C.5 银染 电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板置于固定液中轻轻晃动 3 min；双蒸水快速漂洗 1次，不超过 10 s；染色液中染色 5 min；双蒸水快速漂洗 1次，不超过 10 s；显影液中轻轻晃动直至带纹清晰；固定液中定影 5 min；双蒸水漂洗 1 min。 _
