1、ICS 67050X 04 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 22977-2008牛奶和奶粉中保泰松残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of phenylbutazone residuesin bovine milk and milk powder-LC_MS_MS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施宰瞀徽鬻瓣警糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 昌本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王飞、王海洋、曹彦忠
2、、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳。GBT 22977-2008牛奶和奶粉中保泰松残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22977-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中保泰松残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中保泰松残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶5，0 pgkg，奶粉400 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6
3、3791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792-2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理牛奶和奶粉中保泰松的残留用氨水保持碱性条件，用乙醇、乙醚和石油醚去除脂肪，然后在酸性条件下用四氢呋喃一正己烷混合溶液提取保泰松残留，浓缩后定容，供液相色谱一串联质
4、谱仪测定。外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42甲醇。43乙醇。44氨水：化学纯。45乙醚。46石油醚。47四氢呋喃：色谱纯。48正己烷：色谱纯。49乙腈：色谱纯。410乙酸乙酯。411盐酸。412甲酸铵。413二硫苏糖醇(dithiothreitol，CAS：3483123)：C4H1。02S2，纯度99。414 N，N-Z甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，CAS：68122)：HCON(CH3)2，含量995。】GBT 22977-2008415四氢呋喃一正己烷混合溶液：(1+4)。200mL四氢呋喃(47)与8
5、00mL正己烷(48)混合。416 30molL盐酸：吸取258mL的盐酸(411)于i00mL容量瓶中，用水定容至100mL。417 001 molL甲酸铵溶液：068 g甲酸铵(412)于1 000 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，过02 pm的水性滤膜。418稳定剂：025 mgmL。称取0125 g二硫苏糖醇(413)，用乙酸乙酯(410)溶解并定容至500mL容量瓶中。419标准物质：保泰松(cAs：50一339)，纯度95。420保泰松标准储备溶液：1000 pgmL。准确称取100 mg保泰松标准物质(419)于100 mL容量瓶中，用约80 mL甲醇(42)溶解，加入50 mL稳
6、定剂(418)，用甲醇(42)定容至刻度，混匀。4保存。421中间浓度标准溶液：10 pgmL。吸取10o止保泰松标准储备溶液(420)于IO mL容量瓶中，用流动相定容至刻度。4保存。422基质标准工作溶液：分别吸取50zL、100zL、500 pL、2000止中间浓度保泰松标准溶液(421)，加入20 pL N，N一甲基甲酰胺(418)，用基质空白溶液定容至10 mL，配成50 ngmL、100 ngmL、500 ngmL、2000 ngmL浓度系列标准工作溶液。在4保存，可使用一周。423滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52 天平：感量001 g，00
7、00 1 g。53旋涡混合器。54氮气浓缩仪。55具塞聚丙烯离心管：10 mL。56离心机：可提供2 600 g离心力下(相当于4 200 rmin)。57超声波清洗仪。58振荡器。6试样制备与保存61试样的制备从全部样品中取出有代表性样品约1 kg，充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样的保存将试样于一18保存。7测定步骤71试样提取711牛奶称取1 g试样，精确至001 g，置于10 mL离心管中，加入10 mL乙醇(43)，混匀；加入01 mL氨水(44)，混匀；加入25 mL乙醚(
8、45)，于旋涡混合器混匀20 S，静置5 rain；加入25 mL石油醚(46)，于旋涡混合器混匀20 s，静置5min；小心吸弃上清液后，依次加入5mL四氢呋喃一正己烷混合溶液(415)和04 mL 30 molL盐酸(416)，于振荡器上剧烈振荡30 min；在4 200 rmin离心力下离心10 min。小心吸取上清液于另一10 mL离心管中，用氮气浓缩仪于50水浴中吹至近干。准确加入20 pL N，N-甲基甲酰胺(414)和980 pL 001 molL甲酸铵溶液(417)，于超声波仪2GBT 22977-2008中助溶，残渣溶解后，过02 p-m滤膜(423)，供液相色谱一串联质谱仪
9、测定。712奶粉按照1 g奶粉加水8 mL的比例，将奶粉溶解为还原奶后，按照711的提取步骤进行。72空白样品提取液的制备用阴性样品，按71操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：Intersil C3 pm，150 mmX 21 mm(内径)或相当者；b)进样量：30“L；c)流速：02 mLmin；d)柱温：40；e) 流动相A：001 molL甲酸铵溶液；f)流动相B：乙腈；g)洗脱条件：恒配比A：B为63：37；流速：020 mLmin；时间：100 min。732质谱参考条件质谱参考条件如下：a
10、)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应检测；d)电喷雾电压：500 V；e)雾化气压力：0069 MPa；f)辅助气流速：0414 Lrain；g)离子源温度：500；h)碰撞室出口电压：32 V；i)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压：见表1。表1 保泰松的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压l化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 碰撞气能量V 去簇电压v309160 31 3l保泰松 phenylbutazone 309160309146 30 3174液相色谱一串联质谱测定741定性测定被测组分选择1个母
11、离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差25之内；且待测样品溶液中，被测物中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度的比值K，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度的比值K K50 20K50 10K20 K10允许的最大偏差 土20 土25 土30 士50742定量测定在仪器最佳工作条件下，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲3GBT 22977-2008线。用基质标准工作溶液的工作曲线对样品中的保泰
12、松进行定量，样品溶液中保泰松的响应值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱参考条件和质谱参考条件下，保泰松的参考保留时间546 rain，保泰松的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按试样步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验不称取样品，其余均按试样步骤进行。8结果计算试样中保泰松残留量的计算按式(1)计算：xf筹x丽1 000式中：x试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度；单位为微克每毫升(#gmL)V试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m试
13、样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性实验的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，保泰松的添加浓度范围及重复性方程见表3。表3 添加浓度范围及重复性限和再现性限方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R保泰松 502000 lg r一1036 7 Igm一1032 5 lgR一08361lgm 0427 6注：m为两次测定值的算术平均值。如果差值超过重复性限(r)
14、，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性实验的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，保泰松的添加浓度范围及再现性方程见表3。附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图保泰松标准物质多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。GBT 22977-2008L图A1 保泰松标准物质多反应监测(MRM)色谱图GBT 22977-2008附录B(资科性附录)回收率本方法中保泰松添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 保泰松添加浓度及其平均回收率的试验数据样品基质 添加浓度(pgkg) 平均回收率5o 86O】0，0 893牛奶50O 8632000 89350 935100 919全脂奶粉500 9252000 92650 926100 961脱脂奶粉500 9292000 96150 904100 881全脂加糖奶粉500 889Z000 8886
