1、ICS 67050X 04 囝亘中华人民共$-u国国家标准GBT 22943-2008蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of trimethoprim residues in honeyLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-01实施丰瞀徽紫獬警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1”刖 昌本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹彦忠、贾光群、杨志伟、石玉秋、孙海侠、庞国芳。GBT 22943-2008蜂蜜中
2、三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22943-20081范围本标准规定了蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定。本标准的方法检出限为20 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791
3、 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 5725 2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理蜂蜜中残留的三甲氧苄氨嘧啶用磷酸盐缓冲溶液(pH一9)提取，过滤后，经Oasis HLB”柱或相当的固相萃取柱净化，用甲醇洗脱并蒸干，残渣用流动相溶解，过02 pm滤膜后，样品溶液供液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料41水：GBT 668
4、2，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44磷酸氢二钾(K：HPO；3H。O)：优级纯。45磷酸二氢钾：优级纯。46氢氧化钠：优级纯。47甲酸：优级纯。48 20 molL氢氧化钠：称取80 g氢氧化钠(46)，定容至100 mL。49 01甲酸溶液：吸取10 mL甲酸(47)，用水稀释至1 000 mL。410淋洗液：甲醇溶液(2+3)。量取40 mL甲醇(42)与60 mL水混合。411 02 molL磷酸盐缓冲溶液：称取4386 g磷酸氢二钾(44)和105 g磷酸二氢钾(45)，放人l 000 mL烧杯中，加入800 mL水溶解，用氢氧化钠(46)调至pH值为90，再用水定容至1
5、 000 mL。412流动相：乙腈一01甲酸溶液(7+13)。1)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 22943-2008413标准物质：三甲氧苄氨嘧啶(CAS：738705)，纯度99。414 01 mgmL标准储备溶液：准确称取适量的三甲氧苄氨嘧啶标准物质(413)，用甲醇配成01 mgmL的标准储备溶液。标准储备溶液在4保存。415标准工作溶液：吸取标准储备溶液(414)01 mL移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4保存
6、。416基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液(415)，用空白样品提取液配成20 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、500 ngmL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制。417 Oasis HLB固相萃取柱或相当者：500 mg，6 mL。使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。418滤膜：02 pm。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53氮气浓缩仪。54液体混匀器。55固相萃取装置。56贮液器：50 mL。57真空泵：真空度应达到80 kPa。58 pH科。59吹干管：10
7、mL。6试样的制备与保存61试样的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况-F，置于不超过60的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出05 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。62试样保存将试样于常温下保存。7测定步骤71提取称取2 g试样，精确至001 g。置于1 50mL三角瓶中，加入25 mL磷酸盐缓冲溶液(411)，于液体混匀器(54)上快速混匀1 rain，使试样完全溶解。72净化将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(56)连到Oasis HLB固相萃取柱(417)上，把样液倒入玻璃贮液器中，调节流速小于3 mLmin，使样液通过
8、Oasis HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL淋洗液(410)洗柱，弃去全部流出液。减压抽干20 min，然后用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL吹干管中。用氮气浓缩仪于50吹干。准确加入10 mL流动相(412)溶解残渣，过02“m滤膜后，供液相色谱串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。273测定条件731液相色谱参考条件a) 色谱柱：Atlantis C18，3 pm，150 mnl21 mm(内径)或相当者b)流动相：乙腈一01甲酸溶液(7+13)；c) 流速：02 mLmin；d)柱温：30；e) 进样量：2
9、0 pL。732质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d) 电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：0076 MPa；f) 气帘气压力：0069 MPa；g)辅助气流速：6 Lmin；h)离子源温度：450；i)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。表1 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压GBT 22943-2008化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 碰撞气能量v 去簇电压V291z30 291230 3S 50三甲氧苄氨嘧啶 trimethoprim 291123 402912
10、75 3574液相色谱-串联质谱测定741定性测定被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在土25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示I 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K：10l 允许最大偏差 土20 土25 30 土50742定量测定用标准工作溶液(416)分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。用
11、标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨嘧啶的参考保留时问为239 min。三甲氧苄氨嘧啶的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。3GBT 22943-20088结果计算蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定结果按式(1)计算。Xc芸獬式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(
12、ngmL)y样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度范围及重复性方程见表3。表3 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R三甲氧苄氨嘧啶 2o50 0 lgR0 878 0lg1 212 9 lg尺一1 311 9 lg优一0978
13、 7注：m为两次测定值的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶的添加浓度范围及再现性方程见表3。4附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1。趔 4 0“目督GBT 22943-2008图A1 三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测(MRM)色谱圈GBT 22943-2008附录B(资料性附录)回收率本方法中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及平均回收率的试验数据见表B1。表B1 三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及平均回收率的试验数据化合物名称 掭加浓度(pgkg) 平均回收率2o 104150 990三甲氧苄氨嘧啶loo 1018500 1043
