1、GB/T 18648 2002 前言非洲猪瘟(Africanswine fever，简称ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的种急性、热性、高度接触传染性疾病。其特征为病程短，病死率高，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。为世界动物卫生组织WorldOrganization for Animal Health(英) Office Intentional des Epizootic (法)，OIE和我国规定的动物一类疾病。病毒在鲜肉和脆肉中能存活数月。ASF的实验室诊断分为两类:第一类包括病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的检测;第二类包括抗体的检
2、测。试验方法的选择主要依据本国或本地区的疾病情况而定。在没有ASF但又怀疑该病存在的国家，实验室诊断必须应用无感染性的诊断方法，即应用聚合酶链反应(PCR)检测病毒基因组DNA和应用酶联免疫吸附试验ELlSA)检测血清抗体。我国是无ASF国家，目前尚无ASF的检疫方法。农业部动物检疫所于1997年与美国梅岛动物病研究中心进行了ASF的无感染性快速检测方法的合作研究，建立了适合于我国使用的由可疑感染动物血液和内脏器官中直接检测ASFVDNA的PCR技术，以及检测血清中ASFV抗体的ELlSA方法。本标准对这两种方法技术要求作了规定。本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共
3、和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位g农业部动物检疫所。本标准主要起草人:蒋正军、玉树双、尹燕博、蔡丽娟、郭福生、陆明哲、孙淑芳、龚振华。202 中华人民共和国国家标准非洲猪瘟诊断技术GB/T 18648-2002 Diagnostic techniques for African swine fever 1 范围本标准规定了非洲猪瘟CASF)聚合酶链反应CPCR)和酶联免疫吸附试验CELISA)的技术要求。本标准适用于生猪和野猪等易感动物及其产品ASF的诊断和检疫。2 PCR试验2. 1 材料准备2. 1. 1 样品DNA制备方法见附录AC标准的附录入2.
4、1.2 电泳液缓冲液的配制方法见附录以标准的附录)。2. 1. 3 标准ASFV-BA株DNA、引物1、引物2、1.25 mmol/L dNTP和载样缓冲液。2. 1. 4 台克CTaq)DNA聚合酶、分子量为100碱基对Cbp)Ladder C标准DNAMarker)O和10倍浓度的聚合酶链反应CPCRl扩增缓冲液。2.1.5 自动DNA热循环仪。2.2 操作方法2. 2. 1 将下列试剂按要求量加入到0.75mL的离心管中z灭菌蒸锢水(24.5U;lO倍浓度的PCR扩增缓冲液(5U;1. 25 mmol/L dNTP贮存液(8L);引物1(1Ll;引物20L);样品DNA溶液00 J，L)
5、(见附录A);Taq DNA聚合酶(0.5川.)。2.2.2 设定两个对照，阳性对照为标准的ASFV-BA株的10LDNA含量为10fg;阴性对照为不含DNA的灭菌蒸馆水101.。2.2.3 取50，矿物油覆盖在混合液上。2.2.4 将加有样品或对照混合物的Eppendorf管放入自动DNA热环仪中，按下述程序和条件进行DNA扩增94C5 min.50C2 min , 72C3 min循环次;94C1min.50C2 min , 72C3 min循环30次594 C1 min , 50C2 min , 72C10 min循环一次，最后置于4C保存。2.2.5 上述步骤完成后，从矿物油下小心取出
6、每种反应混合物20L，放入另一支干净的Eppendorf管中并加2L载样缓冲液。2. 2. 6 将所有祥晶按编号加入到对应2%琼脂凝胶(见附录B1)板的各孔中，其中一孔加标准阳性DNA样品，在凝胶的边孔中加入标准分子量DNAMarker。2.2.7 将凝胶在150V恒定电压下电泳2ho 2.2.8 结果判定.用紫外光源检查凝胶。如为阳性样品，则出现一条孤立的、与阳性对照PCR产物的同步迁移的带，分子量为265bpo阴性对照和非ASF感染猪无265bp带。3 酶联免瘦吸附试验(ELISA)31 试剂:标准抗原。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002- 05-01实
7、施203 GB/T 18648-2002 3.2 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(制备方法见附录Cl).底物溶液(见附录C2)。3. 3 操作方法3. 3. 1 取凹_ISA微量滴定板，每孔加人用O.1 mol/L pH7. 2磷酸盐缓冲液稀释至五作滴度的抗原溶液50L，封板后于4C作用16h(过夜)。3. 3. 2 用pH7.2的O.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗板3次，每次2min。3.3. 3 用含0.05%吐温20的O.1 mol/L磷酸盐缓冲液溶液，将待检血清以及阳性和阴性对照血清作30倍稀释，将稀释的血清加入用抗原包被的孔中，每孔中加50L。3. 3. 4 将滴定板放在微量振荡器上.
8、37C作用30min.然后用。.1mol/L磷股盐缓冲液洗3次。3. 3. 5 每孔加入50L用含0.05%吐温20的O.1 mol/L磷酸盐缓冲液配制的免疫球蛋白仙IgG)抗猪过氧化物酶结合物溶液。3. 3. 6 将滴定板放入振荡器，37C作用于1h.然后用。1mol/L磷酸盐缓冲液洗3次。3. 3. 7 每孔加50L底物溶液。3. 3. 8 室温下显色15ffim 0 3. 3. 9 每孔加50L.lmol/L的硫酸终止反应。3.3.10 判定结果:阳性血清可以用肉眼辩认，为清亮的黄色，用ELlSA检测仪检测每一孔的光吸收值，检测波长为492nm。任何一种血清，只要它的吸收值超过同一块板中
9、阴性对照血清平均吸收值的两倍，就可判为是阳性。204 GB/T 18648-2002 附录A(标准的附录)样晶。NA的制备A1 将组织放人有灭菌沙子的研钵中研磨成糊状，加5mL10 mL含1%牛血清O.1 mol/LpH7. 2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，对研碎的组织作10倍稀释，制成组织悬液。A2 全血样品可用含1%牛血清的0.1mol/L磷酸盐缓冲液作1 1 000倍稀释，制成悬液。A3 如为污染物的样品，如粪便等用以上0.1mol/L磷酸盐缓冲液作10倍稀释，制成悬液。A4 500 r /min离心5mino A5 取500L加入有螺旋帽的离心管中，煮沸10mino A6 用小型高
10、速离心机以13000r/min离心5mn。A7 取10L上清液用作PCR试验的样品DNA。B1 琼脂糖凝胶的TAE缓冲液(50倍)二疑币基氨基甲烧碱CTrisbase) 冰乙酸附录B(标准的附录)电泳缓冲液的配制0.5 mol/L pH8. 0)乙二胶四乙酸CEDTA)燕馆水242 g 57.1 mL 100 mL 700 mL 待1:述混合物完全溶解后，加蒸馆水至1000 mL.置4C冰箱中备用，如配制2%的琼腊糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸锢水稀释50倍成TAE缓冲液。B2 2 %琼脂糖凝胶板制备取1g琼脂糖(电泳纯)加入至50mL TAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，加入最终浓度为O.
11、 f lg/mL的漠化乙链，用TAE定容至50mL.冷却至60C后，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，加入恰好没过胶面约1mm深的足童电泳缓冲液。附录C(标准的附录)酶联免瘦吸附试验溶液配制c1 0.1 mol/L确酸盐缓冲液的配制将下列试开IJ按次序加入2000mL体积的容器中。氯化锅80.06 g 氯化何20. 02 g 磷酸氢二锅11. 50 g 205 GB/T 18648-2002 磷酸二氢饵双蒸馆水2.01 g 800 mL ?昆匀，用pH试纸调pH至7.2，用双蒸馆水定容至1000mL，C2 底物溶液邻苯二艘过氧化氢(OPD-H，O，) C2.1 O. 1 mol/L pH5. 0磷酸盐-拧橡酸盐缓冲液将下列试剂按次序加入1000mL体积的容器中，充分溶解即成。磷酸氢二锅(Na，HPO. 12H,O) 拧橡酸71. 6 g 19.2 g 蒸馆水1 000 mL C2.2 底物溶液。1mol/L pH5. 0磷酸盐拧橡酸盐缓冲液邻苯二胶(OPD)30%(过氧化氢)(H,O,) 此液对光敏感，应避免强光直射。现配现用。206 100 mL 40 mg 0.15 mL
