1、ICS 67.040 c 53 中华人民共和国国家标准G/T 18626-2002 肉中有机磷及氨基甲酸醋农药残留量的简易检验方法酶抑制法Method for simple determination of organophosphorus and carbamate pesticide residues in meat Enzyme inhibition method 2002- 01-28发布2002- 06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局发布1 ! j ,) GB/T 18626-2002 、前言本标准在制定过程中主要参考了以下标准:美国公职分析化学师协会AOAC12 2
2、9. 049-29. 055(食品中有机磷农药残留测定一脱喊酶酶抑越法本标准的附录A是规范性麟录。本标准幽辽宁省质量技术监督局提出。本标准由沈阳农业大学、沈阳市质量技术监督局苏家电分局负责起草。本标准主婆越草人z周艳魄、高淑英、张会娟、王晓光、李亮亮、吴小琳、牛森。36 1 范围肉中有机磷及氨基甲酸酣农药残留量的简易检验方法酶抑制法GB/T 18626-2002 本标准规定了用酶抑制法测定肉中有机磷农药及氨基甲酸酣农药残留总量的简易检验方法。本标准适用于肉中有机磷农药及氨基申酸酣农药残留的测定。2 原理有机磷农药及氨基甲酸醋类农药对胆碱酶酶的活性有抑制作用，在一定条件下，其抑制率取决于农药种类
3、及其含量。在pH8的溶液中，腆化硫代乙llI:胆碱被胆碱酣酶水解，生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的2.6-二氯舵盼褪色，褪色程度与胆碱酶酶活性正相关，可在600nm比色测定，酶活性愈高时，吸光度值愈低。当样品提取液中有一定量的有饥磷农药或氨基甲酸黯类农药存在时，酶活性受到抑制，吸光度值则较高。据此，可判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酶类农药的残留情况。样品提取液用氧化剂氧化，可提高某些有机磷农药的抑制率，因而可提高其测定灵敏度，过量的氧化剂再用还原剂还原，以免干扰测定。3试剂3. 1 底物溶液:2%破化硫代乙酷胆碱水溶液.1g磺化硫代乙酷胆碱，加缓冲液溶解并定容至50mL。3. 2
4、缓冲液pH8兰经甲基氨基甲烧(Tris)-盐酸缓冲液:50 mL . 1 mol/L Tris加29.2mL O. 1 mol/L盐酸，加水定容至100mLo 3. 3 显色剂:O. 04 % 2.6二氯能盼水溶液。3.4 氧化剂:0.5%次氯酸钙水溶液。3-5 淫原剂:10%亚硝酸纳水溶液。3.6 胆碱醋酶液.O. 2 g酶粉(其制备方法见附录A)加10mL缓冲液溶解。3. 7 脱色拥IJ:活性炭。3. 8 丙嗣.分析纯。3.9 碳酸钙z分析纯。4 仪器分光光度计。5 分析步骤以下操件可在15C35C温度下进行。5. 1 样晶提取取0.5g肉置l10 mL烧杯中.加5mL两喧闹浸泡5min.
5、不时振摇.再加0.2g碳酸钙。367 GB!T 18626-2002 5. 2 氧化取。.5mL丙酣液于5mL烧杯中，吹干丙酬后，加0.3mL缓冲液溶解。加人氧化剂。.1 mL摇匀后放置10mio，再加入还原剂。3mL.摇匀。5. 3 酶解加入酶液0.2mL.摇匀，放置10min，再加入底物溶液。.2mL.显色剂。.1 mL，放置5min后测定。5.4 测定分光光度计波长调至日00nm，其他按常规操作，读取测定值。6 结果6. 1 测定结果的使用当测定值在1.0以下时，为未检出。当测定值在1.O， 3之间时，为可能检出，但残留量较低。当测定值为，3以上时.为检出。测定值与农药残留量正相关，测定
6、值越高时，说明农药残留量越高。6. 2 方法最低检出浓度本方法最低检出浓度见表1.褒1最低撞出浓度序号农药最低检出辙度序号农药敌敌畏2.0 9 伏最磷2 对硫磷8.0 10 内吸磷3 甲基时硫确3.0 11 甲胶磷4 敌百虫2. 0 12 乙酷甲胶磷5 甲拌确3.0 13 二嚓碗6 乐果3.0 14 峡喃丹7 氧化乐果1. 0 15 西维因8 辛硫磷3.0 16 抗蜻磷; l民单位为毫克每干克最低检出浓度2.0 3.0 20 2.0 5. 0 4.0 2. 0 1. 0 GB/T 8626-2002 A. , 试剂A. ,., 0. mol/L pH6. 0部醺缓冲液附录A(规范性附录)胆碱酣
7、酶粉的制备。ImoI/L磷酸氢二锅溶液d7.56 g磷酸氢二纳(Na2HPO， 2H，O)溶于1000 mL水。0.1 mol/L磷酸二氨销榕液213.80g磷酸二氢销(NaH，PO， 2H，O)溶于1000 mL水。将12.3mL O. 1 moI/L磷酸氢二锅溶液与87.7mL O. 1 moI/L磷酸二氧销溶液混合，即为O. 1 moI/L pH6. 0磷酸缝冲液。A. ,. 2 O. 005 mol/L pH6. 0确.缀冲液取50mL O. 1 mol/L pH6.。磷酸缓冲液(A.1. 1)加水稀释至1000 mL。A.3 0.5 mol/L氢氟化制-0.5mol/L氟化铀瘪液1.
8、0 moI/L氢氧化纳溶液z取40g氮氧化销榕于1000 mL水中。1. 0 mol/L氯化制溶液z取58.5g氯化销溶于1000 mL水中。将上两液1 1 混合，即得0.5mol/L氮氧化销句0.5mol/L氯化锅溶液。A.4 0.5 mol/L盐醺-0.5mol/L氧化纳溶液1. 0 mol/L盐酸溶液.取83.33mL浓盐酸溶于1000 mL水中。 将1.0 moI/L盐酸溶液与1.0 mol/L氯化锅溶液1 1混合，即得0.5mol/L盐酸-0.5mol/L氯化销溶液。A. ,. 5 竣甲基纤维素(CM-纤维素)干粉A.2 装置A. 2. , 梯度混合器两瓶连通式，每瓶容量200mLA
9、. 2. 2 柱层析系统1.5X 40 cm玻璃层析柱，流量可达2mL/min蠕动泵。A. 2. 3 冷冻干燥机。A.3 程序A. 3. , 竣甲基纤维素的处理取10g竣甲基纤维素(CM-纤维素)干粉置于烧杯中，加入100mL 0.5 moI/L氢氧化俐。.5 moI/ L氯化锅溶液，混匀，静置15min后，用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将此滤饼再悬浮于100mL 1 mol/L盐酸溶液中，混匀，静置10min后再用布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100 mL O. 5 moI/L盐酸。.5moI/L氯化纳溶液中，混匀.静置15min后用布民漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。将滤饼悬浮于
10、O.005 moI/L pH6. 0磷酸缓冲液(A.1. 2)中。A. 3. 2 胆事酣酶的提取取50g新鲜食用面粉置三角瓶中，加250mL蒸馆水，振荡30min Q 静置30min以上，取上清液经5000 r/min离心20mno 收集上清液用冷冻干燥机浓缩至20mL左右，为胆碱醋酶粗提掖.保存于冰箱中待纯化。A. 3. 3 胆辅酣酶粗提掖的纯化将处理好的竣甲基纤维素悬浮液加人层析柱中.加150mL 0.005 moI/L pH6.。磷酸缓冲液69 GB!T 18626一-2002(A. 1. 2)于梯度混合器的初始液瓶中，加150mL O. 1 mol/L pH6. 0磷酸缓冲液(A.l.l)梯度混合器的高浓度液瓶中。连接柱层析装置，以2mL/min流速做梯度洗脱，收集后1/2流出液。A. 3. 4 冷冻干燥将A.3. 3中的流出液用冷冻干燥机干燥成干粉，以0.2g/瓶封装于安甜瓶中备用。置4(冰箱中可保存1年有效。370
