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    GB T 14933-1994 小麦中T-2毒素酶联免疫吸附测定方法(ELISA).pdf

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    GB T 14933-1994 小麦中T-2毒素酶联免疫吸附测定方法(ELISA).pdf

    1、GB/T 1493394 1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)。 本标准适用于小麦及其制品中T-2毒素的测定。 本方法的最低检出量为1 g/kg。 第一篇 间 接 法 2 原理 将已知抗原吸附在固相载体表面,洗除未吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争温育后,在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合,再加入酶的底物。在酶的催化作用下, 底物发生降解反应,产生有色产物,通过酶标检测仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中

    2、的抗原量。 3 试剂 本标准所用试剂,凡未指明规格者,均为分析纯,水为蒸馏水或用等纯度的水。 3.1 甲醇。 3.2 石油醚。 3.3 三氯甲烷。 3.4 无水乙醇。 3.5 乙酸乙酯。 3.6 二甲基甲酰胺。 3.7 四甲基联苯胺(TMB)。 3.8 吐温-20。 3.9 30过氧化氢(30H2O2)。3.10 抗体:杂交瘤细胞系1D7产生的抗T2毒素的特异性单克隆抗体。 3.11 抗原:T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)的结合物。 3.12 兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。 3.13 ELISA缓冲液系统 3.13.1 包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,称

    3、取1.59g碳酸钠(Na2CO3),2.93g碳酸氢钠页码,1/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm(NaHCO3),加水稀释至1000mL。 3.13.2 洗液为含0.05吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为: 称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)2.9g氯化钠(NaCl)8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,吐温-20 0.5mL,加水至1000mL。 3.13.3 底物缓冲液为pH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液,配制方法为: 0.1mo

    4、l/L柠檬酸(C6H8O7*H2O),即称取柠檬酸 19.2g,加水至1000mL,为甲液;0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4),即称取磷酸氢二钠 71.7g,加水至 1000mL,为乙液; 取甲液24.3mL,乙液25.7mL,加水至100mL,即可。 3.13.4 底物溶液:取50 LTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中)溶液+10mL底物缓冲液+10L30过氧化氢,混均。 3.14 T2毒素标准溶液 用甲醇配成1mg/mLT2毒素贮备液,20冰箱贮存。于检测当天,精密吸取贮备液,用20甲醇的PBS(配制方法同PBS-T,不加吐温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。

    5、4 仪器 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡,用自来水、蒸馏水冲洗。 4.1 酶标检测仪。 4.2 酶标板(40孔或96孔)。 4.3 电动振荡器。 4.4 电热恒温水浴锅。 4.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。 5 分析步骤 5.1 提取 称取20g粉碎并通过20目筛的样品,置200mL具塞锥形烧瓶中,加8mL水和100mL三氯甲烷无水乙醇(41),密塞,振荡1h,通过滤纸过滤,取25mL滤液于蒸发皿中,置90水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣,洗入250mL分液漏斗中,再用20mL甲醇-水(41)分次洗涤,转入同一分液漏斗中,振摇1.5min, 静置约15min,收下层

    6、甲醇-水提取液过层析柱净化(层析柱的装备:在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱纸棉,尽量塞紧,先装入0.5g中性氧化铝,敲平表面,再加入0.4g活性碳,敲紧)。 将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中,并于水浴锅上浓缩至干,趁热加3mL乙酸乙酯,加热至沸,挥干,再重复一次,最后加3mL乙酸乙酯,冷至室温后转入 浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯页码,2/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm洗涤蒸发皿,并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上,挥干冷却后,用含20甲醇的PBS定容,供ELISA检测之用。 5.2 ELISA检测

    7、 5.2.1 用T-2-BSA(4 g/mL)包被酶标板,每孔100 L,4过夜; 5.2.2 酶标板用PBS-T洗3次,每次3min后,加入不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液 (检测样品中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(11,每孔100 L,该混合液应于使用的前一天配好, 4过夜备用),置371h; 5.2.3 酶标板洗3次,每次3min后,加入酶标二抗,每孔100 L,371.5h; 5.2.4 同上述洗涤后,加入底物溶液,每孔100 L,3730min; 5.2.5 用1mol/L硫酸溶液终止反应,每孔50 L,于450nm处测定吸光度值。 6 计算 7 精密度 本法的

    8、精密度为6.820.3,平行允许差为4.719.2。 第二篇 直 接 法 8 原理 将已知抗原吸附在固相载体表面,洗除未吸附的抗原,加入一定量的酶标记抗体与样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争温育后,在固相载体表面形成抗原抗体酶复合物。洗除多余部分,加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质。通过酶标检测仪,测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量。 9 试剂 本标准所用试剂,凡未指明规格者,均为分析纯,水为蒸馏水或同等纯度的水。 9.1 甲醇。 9.2 石油醚。 9.3 三氯甲烷。 T2浓度(ng/g)= C V1/V2 D1/ M 式中: C酶标板上所测得的T-2

    9、毒素的量(ng),根据标准曲线求得;V1样品提取液的体积mL;V2滴加样液的体积,mL;D样液的总稀释倍数;M样品质量,g。页码,3/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm9.4 无水乙醇。 9.5 乙酸乙酯。 9.6 二甲基甲酰胺。 9.7 四甲基联苯胺(TMB)。 9.8 吐温-20。 9.9 30过氧化氢(30H2O2)。9.10 抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物。 9.11 抗原:T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物(T-2-BSA)。 9.12 ELISA缓冲液系统 9.12.1

    10、包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,称取1.59g碳酸钠(Na2CO3),2.93g碳酸氢钠(NaHCO3),加水稀释至1000mL。 9.12.2 洗液为含0.05吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T) 配制方法为: 称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)2.9g,氯化钠(NaCl) 8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,吐温-200.5mL,加水至1000mL。 9.12.3 底物缓冲液为pH5.0的磷酸柠檬酸缓冲液,配制方法为: 0.1mol/L柠檬酸(C6H8O7H2O), 即称取柠檬酸 19.2g,加水至1000mL,为甲液;

    11、0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4),即称取磷酸氢二钠 71.7g,加水至 1000mL,为乙液; 取甲液24.3mL,乙液25.7mL,加水至100mL,即可。 9.12.4 底物溶液:取50 L TMB(10mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中)溶液+10mL底物缓冲液+10L30过氧化氢,混均。 9.13 T2 毒素标准溶液 用甲醇配成1mg/mLT-2毒素贮备液,20冰箱贮存。于检测当天,精密吸取贮备液,用20甲醇的PBS(配制方法同PBS-T,不加吐温-20即可) 稀释成制备标准曲线的所需浓度。 10 仪器 所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡,用自来水、蒸馏水冲洗。 10.1 酶标

    12、检测仪。 页码,4/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm10.2 酶标板(40孔或96孔)。 10.3 电动振荡器。 10.4 电热恒温水浴锅。 10.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。 11 分析步骤 11.1 提取 称取20g粉碎并通过20目筛的样品,置200mL具塞锥形烧瓶中,加8mL 水和100mL三氯甲烷无水乙醇(41),密塞,振荡1h,通过滤纸过滤,取25mL滤液于蒸发皿中,置90水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣,洗入250mL分液 漏斗中,再用20mL甲醇水(41)

    13、分次洗涤,转入同一分液漏斗中,振摇1.5min, 静置约15min,收下层甲醇水提取液过层析柱净化(层析柱的装备:在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱纸棉,尽量塞紧,先装入0.5g中性氧化铝,敲平表面,再加入0.4g活性碳,敲紧)。 将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中,并于水浴锅上浓缩至干,趁热加3mL乙酸乙酯,加热至沸,挥干,再重复一次,最后加3mL乙酸乙酯,冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿,并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上,挥干冷却后,用含20甲醇的PBS定容,供ELISA检测之用。 11.2 ELISA检测 11.2.1 用T-2-BSA(4 g/mL)包被酶标板,每孔

    14、100 L,4过夜。 11.2.2 酶标板用PBS-T洗3次,每次3min后,加入不同浓度的T2标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品毒素含量)与抗体酶结合物溶液(1100)的混 合液(11,每孔100 L,该混合液应于使用的前一天配好,4过夜备用),置371.5h。 11.2.3 酶标板洗3次,每次3min后,加入底物溶液。每孔100 L,3730min。 11.2.4 用1mol/L硫酸溶液终止反应,每孔50 L,于450nm处测定吸光度值。 12 计算 13 精密度 本法的精密度为5.315.4,平行允许差为5.714.2。 T-2浓度(ng/g)C V1/V2 D1/ m 式中: C酶标板上所测得的T-2毒素的量(ng),根据标准曲线求得;V1样品提取液的体积,mL;V2滴加样液的体积,mL;D样液的总稀释倍数;m样品质量,g。页码,5/5GB/T 14933942006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbrR149330A.htm


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