1、ICS 07. 100 c 53 中华人民共和国国家标准TK基因突变试验TK gene mutation test 2003-09-24发布中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会GB 15193.20-2003 2004-05-01实施发布123 GB 15193.20-2003 前本标准全文强制。本标准参考美国FDA营养素补充剂与食品安全中心食品添加剂安全办公室发布的“食品成分安全评价毒理学原则2000年版红皮书（2001年9月发布）: IV. C . 1. c.小鼠淋巳瘤胸腺略院激酶基因突变试验。V.C . 1. c. Mouse Lymphoma Thymidine Kinase
2、Gene Mutation Assay）”。124 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：四川大学华西公共卫生学院、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：张立实、张建清、帅培强、王怡净。本标准首次发布。GB 15193.20-2003 TK基因突变试验1 范围本标准规定了体外哺乳类细胞TK位点基因突变试验的基本技术要求与方法。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤
3、剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。2 原理TK基因突变试验的检测终点是胸背激酶（thymidine kinase, TK）基因的突变。在人类，TK基因定位于17号染色体长臂远端；在小鼠则定位于11号染色体。放TK基因的突变属于常染色体基因突变。TK基因的产物胸昔激酶在体内催化从脱氧胸昔（TdR）生成胸昔酸（TMP）的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿I;院核背酸（dUM凹，即由胸苦酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMPo但如在细胞培养物中加入胸背类似物（如三氟胸背，即TFT -trifluorothymidine），则TFT在胸昔
4、激酶的催化下可生成三氟胸昔酸，进而掺入DNA，造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸背激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，计算突变频率，以判定受试物的致突变性。3 试Jllj与材料3. 1 细胞，L5178Ytk13.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。为清除自发突变的tkI基因型细胞，在正式实验前，应使用含3g/ml，胸昔，5g/mJ，次黄瞟岭，0.1 g/mL氨甲碟岭和7.5 g/mL甘氨酸的THMG培养基中处理24七，离心、洗涤后在不含氨甲碟岭的THMG培养基中培养3天。3.2 试iIJ
5、, PBS磷酸盐缓冲液，三氟胸昔（trifluorothymidine），次黄嘿岭（hypoxanthine），甘氨酸（glycin时，氨甲碟岭（methotrexate），胸腺I;脆核背（thymidine），阳性对照物（MMS,MMC，环磷酸胶等。4 试验设计一般应进行细胞毒性预试验，根据预试验结果，在相对存活率（relativesurvival, RS）为阴性对照组的20%80%范围内设3个4个剂量（浓度）水平。每次试验均需设阴性（双蒸水）对照，通常亦需设阳性对照。阳性对照通常使用MMS、EMS、MMC、CP（环磷酸胶）等。如使用非水溶剂，则亦需设溶剂对照。5 操作步骤5. 1 培养液和
6、培养条件含10%马血清和适量抗菌素的RPM!1640培养液（96孔板培养时使用含20%马血清的RPM!1640培养液）,5%二氧化碳、37、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。5.2 处理z取生长良好的细胞，调整密度为5105/mL，按1%体积加入受试物，37震摇处理3h。离心，弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPM!1640 培养液中，并调整细胞密度为2l05/mL0125 GB 15193.20-2003 5.3 PE0(0天的平板接种效率）测定取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞mL，接种96孔板（每孔加0.2 mL，即平均1.6个细胞孔），每个
7、剂量作l块2块板，37，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12天，计数每块平板有集落生长的孔数。5.4 表达2步骤（1）所得细胞悬液作2天表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在106/mL以下。计算相对悬浮生长（RelativeSuspension Growth,RSG）。5.5 PE，（第二天的平板接种效率）测定z2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤（2）作梯度稀释并接种96孔板，培养12天后计数每块平板有集落生长的孔数。5. 6 TFT抗性突变频率CtkMF）测定：2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为110 /mL，加入TFT（三氟胸昔，终浓度为3问mL），混匀，接种96
8、孔板（每孔加0.2 ml，即平均2000 个细胞孔），每个剂量作24块板，37，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12天，计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落CLC，直径二三1/4孔径，密度低）和小集落。c，直径1/4孔径，密度高）分别计数，极小集落可再继续培养3天后计数。6 鼓据处理6. 1 平板效率（PEo和PE2)ln(EW/TW) PE二一一一一一一一一一一1. 6 . ( 1 ) 式中EW 无集落生长的孔数；TW一一总孔数；1. 6 每孔接种细胞数。6.2 榈对存活率（%）PE（处理）相对存活率RSC%)= 100 . ( 2 ) PE（对照）6.3 相对悬浮生长（RSGJ一处理
9、组表达期间细胞增殖倍数相对悬浮生长（RSG). ( 3 ) 对照组表达期间细胞增殖倍数6.4 相对总生长（RTGJRTG = RSG RS, ( 4 ) 式中：RS, 第二天的相对存活率，%。6. 5 T盯抗性突变频率（MF)ln(EW/TW)/n MF1日6= PE, ( 5 ) 式中EW 无集落生长的孔数；TW一一总孔数；n 每孔接种细胞数（2000）。应分别计算大集落突变频率CL-MFJ，小集落突变频率（S-MF）和总突变频率（TMF）。6. 6 小集落突变百分率（SCM)小集落突变百分率C%J= (S-MFl/(T MF) ( 6 ) 126 GB 15193.20-2003 7 结果判定7. 1 试验成立的条件阴性对照和溶剂对照的PE,=60%140%,PE2 =70% 130%, T-MF本实验室历史记录的2倍（或24010勺，小集落突变百分率30%60%，阳性对照的T-MF与阴性溶剂对照有显著差异，或比阴性溶剂对照高10010以上。7.2 受试物阳性和阴性结果的判定受试物一个以上浓度组的TMF与阴性溶剂对照有显著差异，或比阴性溶剂对照高100106 以上，并有剂量反应关系，则可判定为阳性。但如仅在相对存活率达20%的高剂量情况下出现阳性，则结果判为“可疑”。阴性结果的判定需在相对存活率达20%的情况下未见突变频率增加方可做出。127
