1、ICS 11.020 C 05 gp 中华人民共和国国家标准GB/T 26351-2010 萤蝶抗药性检测方法德国小蝶不敏感乙酷胆碱醋酶法Test methods of cockroach resistance to insecticides一Test methods of insensitive acetylcholinesterase for Blattella germanica 2011-01-14发布镇轨防伪中华人民共和国卫生部华古中国国家标准化管理委员会保W2011-05-01实施中华人民共和国国家标准萤蝶抗药性检测方法德国小服不敏感乙酷胆暗自旨酶法GB/T 26351-2010
2、峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数8千字2011年4月第一版2011年4月第一次印刷铸书号:155066. 1-42182定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010) 68533533 目。吕本标准按照GB/Tl. 1 2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。GB/T 26351-2010 本标准起草单位:北京市疾病预防控制中心、中国农业大学、中国人民解
3、放军军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人:曾晓菇、高希武、马彦、钱坤、佟颖、梁沛、赵彤言。I GB/T 26351-2010 萤蝶抗药性检测方法德国小蝶不敏感乙酷胆碱醋酶法1 范围本标准规定了德国小蝶(Bla.ttellgermanica)体内不敏感乙酷胆碱醋酶(AChE)的检测方法。本标准适用于德国小蝶对有机磷、氨基甲酸醋类药剂抗药性的生物化学检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文忡。2. 1 乙酷胆碱醋酶区分法度discriminating concentration of acetylcl:!.olinesterase 能够抑制敏感品系德国小蝶乙眈胆碱醋酶正常活性90
4、%的杀虫药剂的浓度，单位为moJ/L或mmol/L。2.2 F1代F1generation 从现场捕捉的德国小牒，繁殖盯得到的第4代。3 试虫现场采集德国小赚，主内饲养.Fl代羽化JI7 d l;j 0的雄们德国小酷。冰梅条件下储存不超过1 d , -20 .C条件下储存不超过1周或-80.C条件下储存6个月以内。4 试剂4. 1 磷酸氢二铀(NazHP04)，化学纯。4.2 磷酸二氢饵(KH2P04)，化学纯。4.3 曲拉通X-100(Triton X-100)。4.4 乙眈硫代胆碱(ATCh)，分析纯。4.5 5，5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)，分析纯。4.6 磷酸缓冲液(0.1mol/
5、L , pH7. 5 PB曰:称取30.18g Naz HP04 12H20和2.16g KHzP04蒸馆水定容至1000 mL。4.7 DTNB乙醇显色剂:称取12.4mg DTNB，溶于125mL 95%乙醇中，加入50mL磷酸缓冲液，最后用蒸馆水定容至250mL ,4 .C避光保存。4.8 ATCh溶液:称取28.9mg ATCh溶于10mL蒸馆水中，一20.C避光保存。4. 9 A TCh-DTNB混合溶液:称取75mg ATCh和13mg DTNB，用100mL磷酸盐缓冲液溶解。1 GB/T 26351-2010 5 分光光度法5. 1 仪器设备5. 1. 1 分光光度计。5. 1.
6、2 恒温水浴箱。5. 1.3 玻璃组织匀浆器。5. 1.4 台式冷冻离心机(离心力10000 g以上)。5. 1. 5 加液器。5.2 杀虫药剂的配制用丙酣或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感德国小蝶品系乙眈胆碱醋酶的区分浓度参见附录A)的2倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。5.3 操作步骤5.3.1 将单头德国小蝶雄性成虫，放入4.C预冷的玻璃组织匀浆器中，加入1mL 4 .C预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.5 ,0.1 mol/L，含O.1 % Triton X-100) ，充分匀浆。5.3.2 匀浆液在4.C ,10 ,000
7、g，离心15min，弃沉淀，取上清即为酶液，冰浴保存备用。5.3.3 取4支试管，分别加入上述酶液0.1mL，在其中3支试管中分别加入杀虫药剂水溶液0.1mL , 使其终浓度达到区分浓度，第4支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液，作为空白对照。5.3.4 将上述5支试管于30.C保温5min，再分别加入0.1mL乙酷硫代胆碱(ATCh), 30 .C继续保温15min后，加入1.6 mL DTNB-乙醇显色剂。5.3.5 以空白对照调分光光度计0点，于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值(ODm)。5.3.6 按上述方法检
8、测100头德国小蝶。5.4 结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(1)。E 门门% =二=二x 100% .( 1 ) ODc 式中:E -AChE残存活性;ODt一一药剂处理管平均光密度值OD412; ODc-元药剂对照管平均光密度值OD山。5.5 判别标准AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE。具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸醋类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。6 酶标仪法6.1 仪器设备6. 1. 1 酶标仪。6. 1. 2 恒温水浴箱。6. 1. 3 玻璃组织匀浆器。6. 1. 4 台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。6.
9、1. 5 加液器。6.2 杀虫药剂的配制GB/T 26351-2010 用丙酣或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液，实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感德国小蝶乙酷胆碱醋酶的区分浓度参见附录A)的2.5倍，溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。6.3 操作步骤6.3. 1 将单头德国小蝶雄成虫，放入40C预冷的玻璃组织匀浆器中，加入1mL 4 oC预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.5,0.1 mol/L，含0.1%Triton X-100)，充分匀浆。6.3.2 匀浆液在4oC ,10000 g离心15min，弃沉淀，取上清即为酶液，冰浴保存备用。6.3.3 在酶标板中的4个孔中分
10、别加入上述酶准0.1mL，在其中3个孔中分别加入一定浓度的杀虫药剂溶液0.05mL，使其终浓度达到区分浓度，第4个孔中加入0.05mL磷酸盐缓冲液作为元药剂对照管，在300C保温5min后，分别加入O.1 mL ATCh-DTNB混合溶液，在412nm测定5min时间动力学曲线，曲线的斜率作为反应初速度(吵。计算平均值。6.4 结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(2)。式中zE -AChE残存活性;Vt 药剂处理组平均反应初速度;E二兰兰x100% V , V，一一元药剂对照组平均反应初速度。6.5 判别标准. ( 2 ) AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE。具有不敏感AChE
11、的个体为对有机磷或氨基甲酸醋类药剂具有抗性的个体，抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。OFON-户的SNH阁。GB/T 26351-2010 附录(资料性附录)常用杀虫药剂对敏感德国小蝶品系Z酷胆础醋酶的区分液度A 表A.l给出了敌敌畏和残杀威对敏感德国小蝶品系乙曹先胆碱醋酶的区分浓度。常用杀虫药剂对敏感德国小蝶品系ZH!i先胆喊醋酶的区分浓度区分浓度杀虫药剂LC90 mol/L 敌敌畏CDDVP)0.056 X 10- 残杀威(propoxur)4. 69 X 10- 注:敏感品系来自北京市疾病预防控制中心医学昆虫饲养室，测定时间为2005年3月。表A.1侵权必究书号:155066.1-42182 定价:峰版权专有14.00 )乙GB/T 26351-2010 打印日期:2011年5月4日F002A
