1、ICS 65.020.20 B 22 GB 中华人民共和国国家标准G/T 20396-2006 三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法Identification of genuineness and varietal purity of three-line hybrid rice and its parents-DNA analysis method 2006-05-25发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2006-11-01实施发布GBjT 20396-2006 目次前言.1 引言.II 1 范围-2 规范性引用文件-3 术语和定义. 4 原理
2、-5 仪器.26 试剂和溶液.27 实验程序.38 鉴定.4 9 结果报告.5附录A(规范性附录)水稻基因组DNA的提取 6 附录B(规范性附录)DNA的纯化及定量.6 附录c(规范性附录)变性聚丙烯酷肢凝胶电泳.7附录D(规范性附录)琼脂糖凝胶电泳附录E(资料性附录)用于杂交水稻鉴定的SSR标记. 10 附录F(资料性附录)用于杂交水稻不育、保持和恢复特征基因检测的分子标记12附录G(资料性附录)相关统计参数及计算.13 参考文献.14 GBjT 20396-2006 刚自本标准的附录A、附录B、附录C、附录D是规范性附录，附录E、附录F、附录G是资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局
3、提出。本标准由全国农作物种子标准化技术委员会归口。本标准起草单位:安徽省农业科学院水稻研究所、安徽国家农业标准化与监测中心、安徽省种子管理总站、合肥丰乐种业股份有限公司。本标准主要起草人:杨剑波、赵伟、陈萍、李莉、汪秀峰、宋丰)1，顶、宣云、张士胜、易成新、孔令传、盛海平、王春生、向太和。本标准为首次发布。I GB/T 20396一2006引在杂交水稻品种审定、生产、制种和销售等过程中，往往需要对品种的真实性和杂交稻种子纯度进行鉴定，常规的方法为种植鉴定、生化检测等，本标准提供的DNA分析方法具有准确度高、时间短、受环境影响小等优点。本标准的制定和实施将对我国杂交水稻种子质量控制起到积极作用。
4、随着杂交水稻新品系、新组合、新类型的选育及DNA分析理论和技术的不断进步，本标准尚需不时进行修订。E 1 范围2 规范性引用文件的修改单(不包括勘误的GB/ T 3543. 1 GB/ T 3543. 2 GB/ T 6682 3 术语和定义GB/ T 3543 . 2、3. 1 聚合酶链式反应一种利用酶促反.!)L如町3. 3 三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法SSR标记simple sequence repeat, SSR GB/T 20396-2006 文件，其随后所有慎协议的各方研究由几个核昔酸(一般为2个6个)为重复单元的长达几十至几百个核昔酸的串联重复序列;由于基
5、本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性;根据SSR座位两侧保守的单拷贝序列设计一对特异引物来扩增SSR序列，即可揭示其多态性。3.4 三系杂交水稻three-Iine hybrid rice 包括不育系、保持系和恢复系，用不育系作母本与其同型保持系杂交繁殖不育系种子，用不育系作母本与恢复系杂交生产杂交稻种子。GB/T 20396-2006 3.5 等位基因频率allele frequency 在-个二倍体的某特定基因座上某一个等位基因占该基因座上等位基因总数的比率，是群体遗传结构的一个最基本的尺度，该基因座上所有等位基因的频率之和为103.6 多态性信息含量polymorphism i
6、nformation contents, PIC 评价-个多态性基因座使用价值的一个量化概念，由该基因座的等位基因数、等位基因频率分布两个因素决定，标记基因座的等位基因数越多、各等位片段的频率越均匀，多态性信息含量(PIC)越大。4 原理品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核昔酸序列不同所致。众多的研究表明，水稻基因组中大量存在着一类简单串连重复序列，其特点为以2个6个核昔酸为重复单位，头尾相连重复几十次至数百次，这类序列称为微卫星DNA。微卫星DNA重复单位的重复次数会出现不同，在不同基因型间同一基因座位的微卫星DNA往往表现为长度等的差异，具有丰富的多态性。根据微E星两端的单拷贝序列设计
7、特异引物，利用PCR技术扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析微卫星DNA多态性，达到区别不同水稻品种(组合)的目的。微卫星标记通常具有共显性的特点，Fl杂交种子具有双亲等位基因的互补带型。鉴于不育系和其同型保持系遗传背景基本一致，只在不育基因、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择DNA分子标记进行分析，从而实现有效的区别与鉴定。上述两者的结合，构成了本标准所指的杂交水稻及其亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法。5 仪器5.1 PCR扩增仪。5.2 高速冷冻离心机:最大离心力二三20OOOg。5.3 DNA定量仪或紫外分光光度计:波长260nm及280nm。5.4 电泳仪:最
8、高电压二三2000 V，最大功率注100W。5.5 垂直测序电泳槽及配套的灌胶附件。5.6 水平电泳槽及配套的灌胶附件。5. 7 微量移液器:规格分别为10L、20L、100L、200L、1000L连续可调。5. 8 低温冰箱:最低温度一200C。5.9 凝胶成像系统或紫外透射仪。5.10 高压灭菌锅:1200C士2C。5. 11 天平:分度值运0.01g , 5. 12 恒温水浴锅:温控精确度:!:lOC。5. 13 摇床。6 试剂和溶液除另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。6. 1 试荆6. 1. 1 异丙醇。6. 1. 2 琼脂糖。6. 1. 3
9、N ,N ,N ，N四甲基乙二胶(TEMED)。6. 1. 4 液氮。6. 1. 5 四种脱氧核昔酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，缩略为dNTP。6. 1. 6 Taq DNA聚合酶。6. 1. 7 DNA标准分子量标记。6.1.8 SSR引物。引物序列参见附录F。6. 1. 9 特征基因引物。引物序列参见附录G。6.2 溶液6.2.1 Z醇体积分数为70%。6.2.2 三氯甲烧+异戊醇十乙醇混合液V(三氯甲t屁)十V(异戊醇)十V(乙醇)=80十4十16。6.2.3 DNA提取液GB/T 20396-2006 100 mmol!L Tris-HC1(pH 8.0)、20mmol
10、!L EDTA(pH 8.0)、500mmol/L NaCl、质量浓度为1.5%的SDSo1. 05 kg/cm2高压蒸汽灭菌15min，40C贮存，用前预热至60oC，使絮状沉淀完全溶解。6. 2. 4 10 X PCR缓冲液500 mmol/L KCl、15mmol/L MgC12 , 100 mmol/L Tris-HCICpH 8.3，室温下)、质量浓度为0.01%的明胶。1.05 kg/cmz高压蒸汽灭菌15min，一200C贮存。6.2.55XTris-珊酸电泳缓冲液(5X TBE) 450 mmol/L Tris-棚酸、10mmol/L EDTA (pH 8. 0) 0 1. 0
11、5 kg/ cm2高压蒸汽灭菌15min，40C贮存。6. 2. 6 50 X Tris-乙酸电泳缓冲班(50X TAE) 2 mol/L Tris-乙酸、50mmol/L EDTA(pH 8.0) 0 1. 05 kg/cm2高压蒸汽灭菌15min，40C贮存。6.2.7 漠化Z键(EB)贮液10 mg/mL澳化乙链(EB)。注:漠化乙绽为强诱变剂，不得直接接触皮肤。6.2.8 加样缓冲液A质量浓度为80%的去离子甲酷胶、10mmol/L EDTA、1mg/mL澳酣蓝、1mg/mL二甲苯氧FF。6.2.9 加样缓冲液B2.5 mg/mL澳酣蓝、质量浓度为40%的震糖。6.2.10 银染固定液
12、体积分数为10%的冰乙酸。6.2.11 染色液1 g/L AgN03、1.5mL/L甲醒。即用即配。6.2.12 显影液30 g/L NaZC03、1.5 mL/L甲醒、2mg/L硫代硫酸锅。即用即配。6.2.13 10%过眼酸按溶液质量浓度为10%的过硫酸接。40C，保存期7天。6.2.14 6%变性聚丙烯酿眼溶液(交联度5%)57 g/L丙烯酷胶、3g/L甲叉双丙烯酷胶、7mol/L服。370C充分溶解后，40C静置保存。注:丙烯酿胶具神经毒性，应注意防护。7 实验程序7.1 样晶制备7. 1. 1 受检样品的杆样、分样和保存，按GB/T3543.2的规定执行。7. 1. 2 试样的数量及
13、淘汰值可参照GB/T3543. 5中的规定执行。检测时应以受检样品所标注品种的GB/T 20396-2006 标准种子作对照，标准对照的真实性应准确无误，如受检样品为杂交种应将其双亲的标准种子也设为对照。7. 2 样品DNA的提取7. 2. 1 材料可取种子提取DNA，也可培养幼苗或从植株取叶片提取DNA。7. 2. 2 种子DNA的提取取单粒种子，剥去颖壳和种皮，碾压使之破碎，移入2.0mL离心管中，加入液氮，用玻棒充分研磨至粉末状。按附录A规定的方法提取DNA。7.2.3 叶片DNA的提取工中，度的4、蝇、浓度模佛tU浓溶提讪MUM刷民站ED本提中1取用新31重11时现，呈弥散状，则表物;
14、0.04U/L Ta 7.4.2 反应程序山啊以标准种子DNA为模板，空白对照以去离子7.5 电泳检测对于SSR标记，应按附录D中规定的方法，采用变性聚丙烯酷肢凝胶电泳进行检测;对于特征基因分子标记，应按附录C中规定的方法，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。8 鉴定8. 1 将受检样品的电泳谱带与标准对照的电泳谱带比较，根据谱带的一致性，鉴定受检样品的真实性和品种纯度。8.2 鉴定时，根据附录E中推荐的SSR标记，先选择12个PIC值较高、位于不同染色体上的SSR位4 G/T 20396-2006 点进行分析，若有2个及2个以上位点与标准对照不一致，则判定该粒种子(幼苗、株)为异品种;若12个位点均
15、与标准对照相同，则判定该粒种子(幼苗、株)为相同品种;若有1个SSR位点与标准对照不一致，则再选用12个SSR位点进行分析。若在新选用的12个SSR位点上又有1个及1个以上位点与标准对照不一致，则判定其为异品种，若新选用的12个SSR位点均与标准对照相同，则判定其为相同品种。在进行SSR分析的同时，应从附录F中选择与受检样品相对应的特征基因标记进行分析。杂交种亲本(不育系、保持系与恢复系)应具有相应基因的特征带型。杂交种子应同时具有相应不育基因和恢复基因的特征带型。8. 3 品种纯度CP)的数值以%表f. C 1 ) 种检定供步白川一、一D式NN9 结果报告5 GB/T 20396-2006
16、附录A(规范性附录)水稻基因组DNA的提取A.l 在处理好的试样中，加600LDNA提取液.60oC水浴1h.每隔15min颠倒混匀一次。A.2 加入等体积三氯甲炕+异戊醇十乙醇，轻缓混匀，室温静置1ho A.3 12000g.40C.离心15min.将上清液转移至另一只1.5 mL离心管中，加等体积异丙醇混匀，室温静置30mino A.4 12 000g.40C.离心15min.弃上清液。A.5 加200L体积分数为70%乙醇洗涤沉淀;离心10min(条件同第A.4章).弃去乙醇;重复洗涤一次。A.6 风干残余乙醇。A.7 将沉淀溶于50L去离子灭菌水中。附录B(规范性附录)DNA的纯化及定
17、量B. 1 RNA的去除在50LDNA样品中，加入2LRNA酶(10mg/mL). 550C水浴保温12h。转入第B.2章去除RNA酶等蛋白质。B.2 蛋白质的去除B. 2. 1 加人等体积的重蒸饱和酷，缓慢颠倒离心管，抽提20min.离心10min02 OOOg).将上清移至新的离心管中。B. 2. 2 加入与上清等体积的三氯甲炕十异戊醇+乙醇，缓慢颠倒混匀10min.离心10min02 OOOg). 将上清移至新的离心管中。B.2.3 重复B.2.2一次。B.2.4 加入二倍体积的冰冷乙醇.1/10体积的3mol/L NaAc.在一200C冰箱中放置20min.离心10 min02 000
18、剖，收集DNA沉淀，弃上清。B.2.5 加入1mL体积分数为70%的乙醇，离心5min02 OOOg).沥干残留乙醇。B. 2. 6 重复B.2. 5一次，风干残留乙醇。B.2.7 溶于去离子水中。B. 3 DNA的定量取DNA样品2L.加去离子水398L.放入比色皿中，用紫外分光光度仪，记录260nm和280nm 的OD值.ODZ60 /ODZ80的值在1.8左右，表明DNA纯度较高。DNA的浓度按式(B.1)计算:6 = 50 X OD260 X 5(且1) 式中:C一-DNA的浓度，单位为纳克每微升(ng/L);S一一稀释倍数。GBjT 20396一2006附录C(规范性附录)变性聚丙烯
19、酷肢凝胶电泳C.1 凝胶制备c. 1. 1 取清洗干净的长、短玻璃板，用去离子水冲洗后晾干，用喷射洗瓶喷无水乙醇，用吸水纸将平板擦干。C.1.2 取经过反硅化处理的长玻璃板(平板)和经过硅化处理的短玻璃板(凹板)，按电泳槽使用于册用0.4mm均厚的垫片组装凝胶胶膜夹层，注意垫片与玻板的边、底压紧对齐。C. 1.3 在50mL 6%变性聚丙烯酷股溶液中加入250L质量浓度为10%的过硫酸胶溶液，50LTEMED，充分泪匀后，立即灌肢。C.1.4 用注射器小心吸出丙烯酷胶溶液，避免吸入气泡。让短平板朝上，并使凝胶平板夹层与桌面成45。角，沿着平板的一边慢慢将丙烯酷胶溶液推入两片平板之间，期间可调整
20、角度让胶液慢慢流入夹层的一边，不在夹层中留有气泡。C. 1.5 当溶液达到短平板的顶部时，放下胶模夹层至其顶部边缘离操作台平面仍有5cm左右，其下垫一物件以使之保持较低的角度，将0.4mm厚的主主鱼齿样品梳的平齐一侧插入胶液中，至短平板下约2 mm3 mm，操作须十分小心以避免产生气泡。用一个书本装订夹将平板之间的样品梳夹紧，以避免在梳子与平板间形成凝胶固块。加一层过量的丙烯酷胶溶液至梳子，保证其被完全覆盖。C. 1.6 待胶凝固后，用刀片除去样品梳周围的过量聚丙烯酷股凝胶。用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯眈胶溶液。拔去主主鱼齿样品梳，避免拉伤凝胶顶部。用水清洗梳子，准备好在C.2.3操作时重
21、新插回样品孔。如果用长城齿梳，小心防止撕裂加样孔。C.2 预电泳C.2.1 凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在2cm3 cm的一层缓冲液中，放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。C. 2. 2 上层贮槽倒入1XTBE缓冲液，使超过凝胶顶部约3cm，用吸管以1XTBE清洗凝胶顶部。C.2.3 将清洗干净的重鱼齿样品梳重新插回凝胶夹层，使其齿部仅可触及凝胶，用吸管以1XTBE缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零星的聚丙烯酷胶碎片。C. 2. 4 加样前，在45V /cm凝胶的电压降下预电泳约30min，吏凝胶预热。C.3 加样C. 3.1 在加样前，清洗加样孔除去浸进孔中的
22、尿素。C. 3. 2 在DNA样品中加入等体积的加样缓冲液A，盖好盖子，950C变性5min，迅速置于冰上。每孔加样2L3L。C.4 电泳在45W70 W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约550C。高于此温度可能会造成玻璃平板炸裂或条带弥散，而太低温度可使DNA不完全变性。观察标志染料的迁移以确定电泳时间。C.5 剥胶从电泳装置中取出凝胶夹层，在自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止，将夹层平放在纸7 GB/T 20396-2006 巾上，凹口玻璃平板(短平板)朝上，除去多余的液体及夹子，取出一边的垫片。两片玻璃平板之间插入一个长金属铲子，轻轻转动铲子将玻璃平板撬起使之分开。C.6 银染C.
23、 6.1 固定将粘有胶的玻璃板放入1500 mL 2 000 mL银染固定液中，使固定液没过凝胶，于摇床上30 r/min轻轻摇动固定20min30 min o C. 6. 2 漂洗取出玻璃板，放入去离子水中课也C. 6. 3 染色将玻璃板放入1500 凝胶，于摇床上轻轻摇动染色30 min。C.6.4 显影取出玻璃板，显影至条带清晰为止。C. 7 照相注:附录8 D. l 凝胶制备附录D(规范性附录)琼脂糖凝胶电泳GB/T 20396-2006 按表D.l选择合适浓度，将lXTAE电泳缓冲液和琼脂糖混合煮沸熔化，冷却至550C，加入澳化乙项目主才好的凝_._-D.2 加样D. 3 电泳接通电
24、D.4 照相9 GBjT 20396-2006 附录E(资料性附录)用于杂交水稻鉴定的SSR标记用于杂交水稻鉴定SSR标记的位点、染色体(连锁群)、正向引物序列、反向引物序列、退火温度及PIC值参见表E.l。表E.l用于杂交水稻鉴定的SSR标记染正向引物序列反向引物序列退火位点色(5 3) (53、核心序列温度/体 RMl llGCGAAAACACAATGCAAAAA GCGTTGGTTGGACCTGAC (AG)26 55 O. 7396 RM6 21GTCCCCTCCACCCAATTC TCGTCTACTGTTGGCTGCAC (AG)16 55 0.5952 RM9 1 IGGTGCCA
25、TTGTCGTCCTC ACGGCCCTCATCACCTTC (GA)15GT(GA)2 55 0.5952 RM16 31CGCTAGGGCAGCATCTAAA AACACAGCAGGTACGCGC TCG) 5 (GA)16 55 0.5729 R岛11712 TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC GGTGATCCTTTCCCATTTCA (GA)21 55 0.6600 R岛12111 ACAGTATTCCGTAGGCACGG GCTCCATGAGGGTGGTAGAG (GA)18 55 0.7266 RM23 1 ICATTGGAGTGGAGGCTGG GTCAGGCTTCTG
26、CCATTCTC GA 55 0.5675 RM72 8 CCGGCGATA八AAC八ATGAGGCATCGGTCCTAACTAAGGG (TAT )5C(ATT)15 55 O. 7299 RM152 81GAAACCACCACACCTCACCG CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG (GGC)10 55 0.4138 RM154 21ACCCTCTCCGCCTCGCCTCCTC CTCCTCCTCCTGCGACCGCTCC (GA) 21 61 0.6211 RM201 91ATCTTCTAGGAAATCGAGGA GTTGGCAACTTGTAGTCTTG CT 55 O. 7041
27、 R如12046 I GTGACTGACTTGGTCATAGGG GCTAGCCATGCTCTCGTACC CT 55 0.6419 RM208 2 TCTGCAAGCCTTGTCTGATG TAAGTCGATCATTGTGTGGACC CT 55 0.6773 RM224 11 ATCGATCGATCTTCACGAGG TGCTATAAAAGGCATTCGGG (AAG)8(AG)13 55 0.8587 RM228 10 CTGGCCATTAGTCCTTGG GCTTGCGGCTCTGCTTAC CCA)6CGA)36 55 0.7119 RM241 41GAGCCAAATAAGATCGC
28、TGA TGCAAGCAGCAGATTTAGTG CT 55 0.6563 RM254 11 AGCCCCGAATAAATCCACCT CTGGAGGAGCATTTGGTAGC (TC) 6ATT C CT) 11 55 0.6901 RM260 II ACTCCACTATGACCC八GAGGAACAATCCCTTCTACGATCG CT 55 O. 6156 RM264 81GTTGCGTCCTACTGCTACTTC GATCCGTGTCGATGATTAGC (GA)27 55 0.7147 RM276 6 CTCAACGTTGACACCTCGTG TCCTCCATCGAGCAGTATCA
29、(AG)8A3(GA)33 55 O. 7888 RM277 12 CGGTCAA八TCATCACCTGACCAAGGCTTGCAAGGGAAG (GA) l1 55 0.5261 RM307 4 GTACTACCGACCTACCGTTCAC CTGCTATGCATGAACTGCTC (AT)14(GT)21 55 0.7258 RM336 71CTTACAGAGAAACGGCATCG GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG (CCT)18 55 O. 7507 RM346 7 CGAGAGAGCCCATAACTACG ACAAGACGACGAGGAGGGAC (CTT)18 55 0.45
30、67 RM413 5 GGCGATTCTTGGATGAAGAG TCCCCACCAATCTTGTCTTC (AG)11 55 O. 7029 RM474 10 AAGATGTACGGGTGGCATTC TATGAGCTGGTGAGCAATGG (AT) 13 55 0.8255 R岛148410 TCTCCCTCCTCACCATTGTC TGCTGCCCTCTCTCTCTCTC (AT)9 55 O. 6424 一一L 一10 GB/T 20396-2006 表E.1 (续)染正向引物序列反向引物序列退火位点色(5 3) (5 3) 核心序列温度/PIC 体。CRM586 61ACCTCGCG
31、TTATTAGGTACCC GAGATACGCCAACGAGATACC (CT)23 ;5 5 o. 3ii66 R肌159010 CATCTCCGCTCTCCATGC GGAGTTGGGGTCTTGTTCG (TCT) 10 55 o. 602引RM592 51TCTTTGGTATGAGGAACACC AGAGATCCGGTTTGTTGTAA (ATT)20 55 o. 6361 RM598 51GAATCGCACACGTGATGAAC ATGCGACTGATCGGTACTCC (GCAl9 55 0.4549 RM1385 21ATGACAGGTAAGGTGTGGTG TGAACATCAT
32、CTTCGAATCC AG 55 o. 5035 RM1986 12 TAACGGAGGGAGTAGTTTTC GAACCTACATATCGAGAGCA AT 55 0.8712 R孔1250410 TAACACAACAATAGCGTCAG TAGGAAGAACTGAAGAAGCA AT 55 0 早832日41 RM3133 11 TCAATAGACACACGGGCATG CGATTTTGCTCACTGCACAG CA 55 o. RM3331 12 CCTCCTCCATGAGCTAATGC AGGAGGAGCGGATTTCTCTC CT 50 o. 6424 RM3628 61AATCAT
33、GCCTAGAGCATCGG GTTCAACATGGGTGCAGATG GA 55 o. 5862 RM3838 51TTGTAGATGTTGCCAGTTTG TGTTGACATCTGTGAGCCGG GA 55 0.7881 RM5095 10 CTATATGACTATGCGAATGG ACAAATGCAACTAAGGTAGA TA 55 o. 7839 R岛154734 ACCACAAACGATCGCGTC GAGATTAACGTCGTCCTCCG TC 55 0.7715 R肌1547912 AACTCCTGATGCCTCCTAAG TCCATAGAAACAATTTGTGC TC 55
34、0.8283 RM5857 12 ACAGCTTGTCTTTATTTCCTG GATGGTAATCCAGGTTGTTG ATA 55 o. 5805 RM6748 4 ATTGGGTTTCTCATATTATG CCAACACTCCTAACTAGTTC TAT 55 o. 8310 RM7102 12 TGCCCAAAATATATGAAACC TTTTCTTGTTGAATGGGAAC ATAA 55 o. 8061 RM7389 3 AGCGACGGATGCATGATC TTGAGCCGGAGGTAGTCTTG GATA 55 0.6025 RM8209 3 AGGAGAAGAGGAATCTTT
35、GC CGATCGAGAGCTACTATTGC AG 55 O. 6250 RM8277 3 AGCACAAGTAGGTGCATTTC ATTTGCCTGTGATGTA八:fAC.r二CTT 55 0.4549 OSR28 9 AGCAGCTATAGCTTAGCTGG ACTGCACATGAGCAGAGACA 八GA55 O. 6371 注:表中PIC值为36个水稻品种统计结果。11 GB/T 20396-2006 附录F(资料性附录)用于杂交水稻不育、保持和恢复特征基因检测的分子标记用于杂交水稻不育、保持和恢复特征基因检测分子标记的标记特征、正向引物序列、反向引物序列及扩增片段大小参见表F.
36、l。表F.1 用于杂交水稻不育、保持和恢复特征基因检测的分子标记标记特征SCAR-W A-CMS (检测水稻野败型不育基因SCAR-WM(检测水稻野败型保持基因)RM1-Rf3(检测水稻野败型恢复基因)RM228-Rf4(检测水稻野败型恢复基因)SCAR-BT-CMS (检测水稻BT型不育基因)SCAR-Rf1 (检测水稻BT型恢复基因)SCAR-HL-CMS (检测水稻HL型不育基因)RM6737- Rf5 (检测水稻HL型恢复基因)注:以上标记的退火12 扩增片段长度/bp386 808 114 237 590 240 187 GB/T 20396-2006 附录G(资料性附录)相关统计参
37、数及计算G.l 等位基因频率Callelefrequency) 在一个二倍体田某特定基因座上某一个等位基因占该基因座上等位基因总数的比率，是群体遗传结构的一个最基本的尺度，该基因座上所有等位基式中:nj一一含等位基因i的n2-一含有该等位基分布两个因素决定。设遗传标记等bP 2 ，P3，Pn。式中:X 多态性信息Pi -第i个等位数不能提供信，位基因频率分别为Pj，13 GB/T 20396-2006 14 参考文献lJ萨姆布鲁克，拉塞尔.分子克隆实验指南(第三版)M.北京:科学出版社，2002.【2J杨剑波，汪秀峰，赵成松，等.水稻线粒体DNA中与雄性不育有关片段的克隆及序列分析口.遗传学报
38、，2002，29(9):808-813.3J杨剑波，汪秀峰，赵成松，等.野败型水稻保持系线粒体特异片段的克隆及序列分析1.植物生理与分子生物学学报，2003，29(3):199-205.4J王中华.水稻BT型细胞质雄性不育基因和恢复基因的分离及其相互作用机理研究D.广东:华南农业大学，2004.5J许仁林，谢东，师素云，等.水稻线粒体DNA雄性不育有关特异片段的克隆及序列分析J.植物学报，1995，37(7):501-506.6J景润春，何予卿，黄青阳，等.水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因的ISSR和SSLP标记分析口.中国农业科学，2000，33(2):10-15.7J易平，朱英国，等.红莲
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