1、 ICS 65.120 B 46 备案号： 14778-2004 浙江省地方标准DB33/T 4592003饲料添加剂 饲料用复合酶制剂 Feed additives Complex enzymatic preparation for feed 2003-12-09 发布 2004-01-01 实施浙江省质量技术监督局 发布DB33DB33/T 4592003 I 目 次 前言 . . III 引言 . . IV 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 产品分类、酶种范围及安全性 . 2 5 要求 . . 2 6 试验方法 . . 3 7 检验规则
2、 . . 4 8 标志、标签 . . 5 9 包装、运输、贮存 . 5 A.1 原理 . . 6 A.2 试剂和溶液 . . 6 A.3 仪器和设备 . . 7 A.4 测定步骤 . . 7 A.5 酶活力计算 . . 8 A.6 精密度 . . 8 附录 B . 9 B.1 原理 . . 9 B.2 试剂和溶液 . . 9 B.3 仪器和设备 . . 9 B.4 测定步骤 . . 10 B.5 酶活力计算 . . 11 B.6 精密度 . . 11 附录 C . 12 C.1 原理 . . 12 C.2 试剂和溶液 . . 12 C.3 仪器和设备 . . 12 C.4 测定步骤 . . 1
3、3 C.5 酶活力计算 . . 14 C.6 精密度 . . 14 附录 D . 15 D.1 原理 . . 15 D.2 试剂和溶液 . . 15 D.3 仪器和设备 . . 15 D.4 测定步骤 . . 16 D.5 酶活力计算 . . 17 D.6 精密度 . . 17 附录 E . 18 DB33/T 4592003 II E.1 国际酶活力单位 . . 18 E.2 轻工部行业标准酶活力单位 . 18 E.3 国内其它资料酶活力单位 . 19 DB33/T 4592003 III 前 言 本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D 为规范性附录，附录 E 为资料性附录。 本标准
4、由浙江省饲料与动物保健品协会提出。 本标准由浙江省饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位：浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所。 本标准参加起草单位：浙江省饲料监察所、浙江 王 景 宝饲料股份有限公司、长兴蓝鑫生物技术有限公司、长兴大洋生物饲料有限公司。 本标准主要起草人：许尧兴、楼洪兴、方阿庆、苏卫琴、王有良、宣士荣、汪刚。 DB33/T 4592003 IV 引 言 本标准是针对以微生物发酵法生产、含有二种或二种以上主要功效酶成分、经配置而成的饲料用复合酶制剂。 考虑到市场上的饲料用复合酶制剂品种繁多，等级不一，酶活标示方法各不相同，故制定本标准，以统一我省饲料用复合酶制剂中
5、主要酶系的酶活力单位定义， 相关酶系的酶活力测定方法的及产品中各种酶的最低酶活指标，便于科研、生产、销售和使用单位的相互交流和使用。 产品分类中，饲料用复合酶制剂根据畜禽种类和日粮类型不同而分为通用、猪用、禽用及水产动物用几种类型。而每种类型又可根据具体的日粮或畜禽生长阶段细分成若干种类型。适用本标准中饲料用复合酶制剂的主要酶种有：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、-葡聚糖酶和纤维素酶。本标准特别强调了饲料用复合酶制剂的安全性，指出：由发酵法，特别是固体发酵法生产获得的饲料用复合酶的酶源，需说明相应酶种的产生菌种及安全性。采用的产酶菌种应是我国农业部 105 号公告公布的允许使用的 12 种饲
6、料级微生物菌种，或应符合食品添加剂使用的菌株为酶源的发酵菌株。 附录 A 所述的“蛋白酶活力测定方法”是参照轻工部行业标准 QB 1805工业用蛋白酶制剂的有关规定执行。附录 B、附录 C、附录 D 是通过测定几种非淀粉多糖酶（木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶）分解相应底物生成的还原糖来反映几种酶的总酶活力。附录 E 是资料性附录，将本标准中几种非淀粉多糖酶的酶活力与国际酶活力及国内其它单位表示方法所获得的酶活力之间的换算。 生产者和使用者可根据不同产品酶活力表示方法，进行相互换算，以资比较。 由于饲料用酶制剂基本上采用微生物发酵生产，酶系组成、相关浓度和化学结构的不确定性，以及作用底物（饲料原料
7、）的多样性，各种终产物的不断形成及反馈控制等因素的影响，因此，各实验室严格按照标准规定的底物、pH、反应时间与温度等条件操作是十分重要的。 本标准的卫生指标部分参照了FAO/WHO下属的JECF食品添加剂纲要第一卷中食品工业用酶制剂通则中的“卫生指标”,以及国家轻工部行业标准工业用酶制剂通用试验方法中有关食品级酶制剂的卫生指标；本标准酶活力的测定，参考了国家有关行业推荐的方法及国内外、省内外相关企业标准的测定方法和国内外相关资料，通过反复试验，修改而成。 DB33/T 4592003 1 饲料添加剂 饲料用复合酶制剂 1 范围 本标准规定了饲料添加剂饲料用复合酶制剂的术语和定义、产品分类、要求
8、、试验方法、检验规则和标志、标签、包装、运输、贮存条件。 本标准适用于在浙江省境内生产、销售、使用的饲料用复合酶制剂产品。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 191-2000 包装、储运、图示标志 GB/T 5917-1986 配合饲料粉碎粒度测定方法 GB/T 6435-1986 饲料水分的测定方法 GB 10648 饲料标签 GB/T 130
9、79 1999 饲料中总砷的测定 GB/T 13080 1991 饲料中铅的测定方法 GB/T 13082 1991 饲料中镉的测定方法 GB/T 13091-2000 饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T 17480 1998 饲料中黄曲霉毒素 B1的测定 酶联免疫吸附法 GB/T 18869-2002 饲料中大肠菌群的测定 QB/T 1803 工业用酶制剂通用试验方法 国家技术监督局(1995)第 43 号令定量包装商品计量监督规定 3 术语和定义 下列术语、定义适用于本标准。 3.1 饲料用酶制剂 Enzymatic Preparation for Feed 饲料用酶制剂是通过产酶微生物发
10、酵工程或含酶动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或 几种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品。 3.2 饲料用复合酶制剂 Complex Enzym atic Preparation for Feed 产品中含有二种或二种以上主要功效酶成分，这些酶是依据饲料原料和动物消化生理不同而特定复 配，对饲料中多种成分具有酶催化作用的饲料用酶制剂。 3.3 原料酶 Materia l Enzyme 以微生物为产酶菌种，采用固体发酵工程途径生产，经低温干燥所获得的、未添加任何其它载体的固体酶曲，定义为原料酶。
11、 DB33/T 4592003 2 3.4 酶活单位 Enzymatic Unite 根据作用底物的不同，对饲料用复合酶中相关酶种的酶活单位作如下定义。 3.4.1 蛋白酶 Protanase 在（ 40 0.2）、相应的 pH 条件下 (酸性蛋白酶 pH3.5,中性蛋白酶 pH7.0)，在 1min 内水解酪蛋白底物，产生相当于 1 微克酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为 1 个酶活单位，以 u/g(u/ml)表示。 3.4.2 木聚糖酶 Xylanse 在（ 40 0.2）、 pH 5.0 条件下，在 1min 内水解木聚糖底物，产生相当于 1 微克木糖的还原糖的酶量，为 1 个酶
12、活单位，以 u/g(u/ml)表示。 3.4.3 -葡聚糖酶 -glucanase 在（ 40 0.2）、 pH 5.0 条件下，在 1min 内水解 - 葡聚糖底物，产生相当于 1 微克葡萄糖的还原糖的酶量，为 1 个酶活单位，以 u/g (u/ml)表示。 3.4.4 纤维素CMC酶 Cellulase 在（ 40 0.2）、pH 4.2 条件下，在 1min 内水解羧甲基纤维素钠底物，产生相当于 1 微克葡萄糖的还原糖的酶量，为 1 个酶活单位，以 u/g(u/ml)表示。 4 饲料用复合酶制剂的分类、酶种范围及安全性 4.1 饲料用复合酶制剂的分类 饲料用复合酶制剂根据畜禽种类和日粮类
13、型不同而分为通用、猪用、禽用及水产动物用几种类型。而每种类型又可根据具体的日粮或畜禽生长阶段细分成若干种类型 (详见表 1)。 4.2 饲料用复合酶制剂的酶种范围 适用本标准中饲料用复合酶制剂的主要酶种有：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、-葡聚糖酶和纤维素酶。其它酶种可根据需要适当调整。 4.3 饲料用复合酶制剂的安全性 由发酵法，特别是固体发酵法生产获得的饲料用复合酶的酶源，需说明相应酶种的产生菌种及安全性。采用的产酶菌种应是我国农业部105号公告 公布的允许使用的12种饲料级微生物菌种，或应符合食品添加剂使用的菌株为酶源的发酵菌株。 5 要求 5.1 感官指标 色泽均匀，无发霉变质、结块
14、及异味异嗅。 5.2 酶活力指标 饲料用复合酶产品中的酶系及酶活力指标应符合表 1 规定。 表中所示酶活力指标为产品中最低酶活力指标（以该酶制剂产品在饲料中添加量 0.1%计，若添加量大于或小于 0.1%,其产品中的相应酶活可适当降低或增加） 。 DB33/T 4592003 3 表 1 饲料用复合酶制剂的酶活力指标 产 品 型 号 产 品 成 份 标 签 值(u/g) 通用小麦型复合酶 酸性蛋白酶1000 木聚糖酶250 00 -葡聚糖酶5000 纤维素酶 2500 通用玉米型复合酶 酸性蛋白酶 2000 木聚糖酶 10000 -葡聚糖酶 5000 纤维素酶 1500通用稻谷型复合酶 酸性蛋
15、白酶 1000 木聚糖酶 15000 纤维素酶 3500 - 乳仔猪用复合酶 酸性蛋白酶 2500 木聚糖酶 10000 中性蛋白酶 1000 纤维素酶 1000猪用玉米型复合酶 酸性蛋白酶 2000 木聚糖酶 10000 -葡聚糖酶 10000 纤维素酶 2000 猪用小麦型复合酶 酸性蛋白酶 1500 木聚糖酶 25000 -葡聚糖酶 10000 纤维素酶 2500 猪用大麦型复合酶 酸性蛋白酶 1000 木聚糖酶 10000 -葡聚糖酶 20000 纤维素酶 2000 禽用玉米型复合酶 酸性蛋白酶 2000 木聚糖酶 15000 -葡聚糖酶 10000 纤维素酶 1200 禽用小麦型复合
16、酶 酸性蛋白酶 1000 木聚糖酶 20000 -葡聚糖酶 10000 纤维素酶 2000 肉鸡用复合酶 酸性蛋白酶 1500 木聚糖酶 15000 -葡聚糖酶 10000 纤维素酶 1500 蛋鸡用复合酶 酸性蛋白酶 1000 木聚糖酶 20000 -葡聚糖酶 10000 纤维素酶 1500 水产动物 (甲鱼 )用复合酶 酸性蛋白酶 1500 中性蛋白酶 3000 - - 注：以上各产品中的酶系及酶活力指标，可按应用原料的不同作适当调整。 5.3 卫生指标 卫生指标应符合表 2 的规定。 表 2 饲料用复合酶制剂的卫生指标 砷，mg/kg,（以 As 计） 5.0 铅，mg/kg,（以 Pb
17、 计） 10.0 镉，mg/kg,（以 Cd 计） 0.5 沙门氏菌， 不得检出 大肠菌群，MPN/100g 3000 黄曲霉毒素 B 1, mg/kg 0.05 注： 不得检出国家明令禁止的药物和物质。 5.4 粒度 孔径 0.325mm（60 目筛）分析筛筛上物，不大于 20%。 5.5 水分 不大于 10%。 5.6 净含量 按国家技术监督局（1995）第 43 号令执行。 6 试验方法 6.1 感官要求 取样品适量，进行感官检验，观察、嗅闻或触摸。 6.2 酶活力 DB33/T 4592003 4 6.2.1 蛋白酶活力（酸性、中性） 按附录 A 测定。 6.2.2 木聚糖酶活力 按附
18、录 B 测定。 6.2.3 -葡聚糖酶活力 按附录 C 测定。 6.2.4 纤维素 CMC酶活力 按附录 D 测定。 6.3 砷（As） 按 GB/T13079-1999 执行。 6.4 铅（Pb） 按 GB/T 13080-1991 执行。 6.5 镉（Cd） 按 GB/T13082-1991 执行。 6.6 沙门氏菌 按 GB/T 13091-2000 执行。 6.7 大肠菌群 按 GB/T 18869-2002 执行。 6.8 黄曲霉毒素 B 1 按 GB/T 17480-1998 执行。 6.9 水分 按 GB/T 6435-1986 执行。 6.10 粒度 按 GB/T 5917-1
19、986 执行。 6.11 净含量 用适宜感量的衡器进行检验。 7 检验规则 7.1 组批的定义 生产厂以每一班次生产且经包装的、具有同样工艺条件、同一产品名称、批号、规格和同样质量证明书的产品为一个组批。 7.2 取样方法 从每批产品的包装中随机抽取。用清洁适用的取样工具伸入所取样品的四分之三深处，用交叉法 取出足够量的样品，将采得的样品充分混合均匀按四分法缩分至 250g，平分装入两个清洁、干燥具有密闭性和避光性的具塞样品瓶中，贴上标签，注明生产厂名称、产品名称、批号、取样日期等。 7.3 检验分类 产品分为出厂检验和型式检验。 7.3.1 出厂检验 7.3.1.1 出厂检验项目 感官指标、
20、酶活力、水分、粒度、净重。 7.3.1.2 判定方法 对抽取的样品按出厂检验项目进行检验，如果检验结果中有任何一项指标不合格时，应重新取样进行复检，取样范围或样品数量为第一次取样量的两倍，复检结果中仍有指标不合格，则整批产品判为不DB33/T 4592003 5 合格，不能出库。 7.3.1.3 判定结论 每批产品应由生产厂质量检验部门进行出厂检验，只有检验合格后方可签发合格证出厂。 7.3.2 型式检验 7.3.2.1 型式检验项目 型式检验的样品必须从出厂检验合格产品中随机抽取。 型式检验项目为本标准“5 要求”中各项指标。 7.3.2.2 型式检验的范围 有下列情况之一时，应进行型式检验
21、： a).审发生产许可证、产品批准文号时； b).产品的原辅材料、工艺过程及主要设备有较大变化时； c).停产 6 个月以上，恢复生产时； d).出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时； e).当用户对产品质量有较大异议时。 7.3.2.3 判定方法 对抽取的样品按型式检验项目进行检验，如果检验结果中有任何一项指标不合格时，应重新取样进行复检，但卫生指标如有一项不合格时，即判为不合格产品，不得复检。复检的取样范围或样品数量是第一次取样的两倍。复检结果仍有指标不合格，则判为不合格产品。 8 标志、标签 8.1 标志 产品的外包装应有产品名称、生产厂家、规格、注册商标、生产许可证号、产品批准文号、
22、净重、防潮防晒标志，同时还应注明“饲料添加剂”字样，并采用鲜明的饲料标签，符合 GB/T 191-2000 规定。 8.2 标签 按 GB 10648 执行。 9 包装、运输、贮存 9.1 包装 产品的包装需具备：密封、防水、避光、一定的强度要求和一定的包装规格等。 9.2 运输 产品含有生物活性物质，光线、温度、湿度易引起失活。运输工具必须清洁、干燥，有防雨防晒设施，搬运装卸小心较放。不得与有毒有害及其它污染物品混装混运。 9.3 贮存 产品需于阴凉、干燥、避光处贮存。贮存仓库需保持清洁、阴凉、干燥、通风，防受热、受潮。 不得与有毒有害及其它污染物品混贮。 9.4 保质期 产品原包装需注明保
23、质期。在本标准规定条件下，保质期为 6 个月。 DB33/T 4592003 6 附 录 A （规范性附录） 蛋白酶活力的测定方法 A.1 原理 蛋白酶在一定的温度和 pH 条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸） ，在碱性条件下，将福林试剂（ Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在 660nm 测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。 A.2 酶活单位定义 在（ 40 0.2）、相应的 pH 条件下 (酸性蛋白酶 pH3.5,中性蛋白酶 pH7.0)，在 1min 内水解酪蛋白底物，产
24、生相当于 1 微克酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为 1 个酶活单位，以 u/g(u/ml)表示。 A.3 试剂和溶液 除非另有规定外，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。 A.3.1 1 mol/L及0.1 mol/L盐酸 (HCl)溶液 取浓盐酸 85ml，加水稀释并定容至 1000 ml，即为 1mol/L 盐酸溶液；取 100ml 1mol/L 盐酸溶液，定容至 1000 ml，即为 0.1 mol/L 盐酸溶液。 A.3.2 1mg/ml L-酪氨酸标准贮备溶液 精确称取预先于 105 oC 干燥至恒重的 L-酪氨酸 0.1000g，用 20ml 左右 1mo
25、l/L 盐酸 l 溶解后，再用蒸馏水定容至 100ml，即为 1mg/ml 酪氨酸标准溶液。 A.3.3 L-酪氨酸标准使用溶液 吸取 1mg/ml 酪氨酸标准溶液 10.0 ml 用 0.1 mol/L 盐酸定容至 100 ml,即得到 100 g/ml L-酪氨酸标准液。 分别吸取 100 g/ml L-酪氨酸标准液 0ml、 1.0ml、 2.0ml、 3.0ml、 4.0ml、 5.0ml、 6.0 ml 于 10ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，制成每 ml 分别含 L-酪氨酸 0 g、 10 g、 20 g、 30 g、 40 g、50 g、 60 g 的标准使用溶液。 A
26、.3.4 0.4 mol/L 碳酸钠（Na 2CO3）溶液 称取无水碳酸钠（ Na2CO3） 42.4g，用蒸馏水溶解并定容至 1000ml。 A.3.5 福林（Folin）试剂 于 2000ml 磨口回流装置中加入钨酸钠 (Na2WO4.2H2O)100g、钼酸钠 (Na2MoO4.2H2O)25g、蒸馏水700ml、 85%磷酸 50ml、浓盐酸 100ml。小火沸腾回流 10h，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂（ Li2SO4） 50g，加蒸馏水 50ml 和数滴浓（ 99%）溴水，再微沸 15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴） ，冷却后加蒸馏水定容
27、至 1000ml。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以 1 份原 Folin 试剂与 2 份蒸馏水混匀，制成稀 Folin 试剂。 A.3.6 乳酸缓冲液(pH=3.5),适用于酸性蛋白酶 甲液：称取 80% 90%乳酸 10.6 g，加水稀释并定容至 1000ml。 乙液：称取 70%乳酸钠 16 g，加水稀释并定容至 1000ml。 使用液：取甲液 2 份，加乙液 1 份，再准确稀释 1 倍。用 pH 计校正 pH 至 3.5。 DB33/T 4592003 7 A.3.7 磷酸缓冲液（pH=7.0）,适用于中性蛋白酶 甲液：称取磷酸氢二钠（ Na2HPO4.12H2O
28、） 71.64 g, 用蒸馏水溶解，并定容至 1000ml。 乙液：称取磷酸二氢钠（ NaH2PO4.2H2O ） 31.21 g，用蒸馏水溶解，并定容至 1000ml。 . 使用溶液：取甲液 610ml，加乙液 390ml 混合均匀，用 pH 计校正至 pH 为（ 7.0 0.05） ,备用。 A.3.8 1.0%酪素溶液 称取酪素 1.0000g，先用少量（ 3ml-4ml）浓乳酸湿润后， （若中性蛋白酶为少量 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液） ，再加入相应 pH 缓冲液约 80ml,在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入 100ml 容量瓶中，用相应缓冲液定容至刻度。此溶液在
29、4oC 冰箱贮存，有效期为 3 天。 A.3.9 0.4 mol/L三氯乙酸(CCl3-COOH)溶液(沉淀试剂) 称取三氯乙酸 65.4g，用蒸馏水溶解并定容至 1000ml。 A.4 仪器和设备 除普通实验室仪器外，还应有： A.4.1 恒温水浴锅(400.2) oC。 A.4.2 分光光度计 A.4.3 酸度计 精度0.01pH 。 A.4.4 分析天平 感量0.1mg。 A.4.5 秒表或定时钟。 A.5 测定步骤 A.5.1 标准曲线绘制 按表 A.1，分别吸取标准酪氨酸标准使用溶液、0.4mol/L 碳酸钠溶液和稀 Folin 试剂于各管中（每管号平行作 3 个样） ，混匀。 将标
30、准管同时置于 40oC 水浴，反应 20min，取出，迅速冷却至室温，用 10mm 比色杯，以空白管（ 0 号管）调仪器零点，在分光光度计波长 660nm 处测吸光度。以酪氨酸量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。当吸光度为 1 时的酪氨酸量（ g）即为比色常数 K 值。 线性回归系数（ r）应在 0.9990 以上时方可使用（否则须重做） 。对每个新配制的 Folin 试剂制作新的标准曲线。 表 A.1 酪氨酸标准曲线 标准酪氨酸使用溶液 管 号 浓度（ g/ml） 吸取量（ ml） 0.4mol/L 碳酸钠溶液(ml) 稀 Folin 试剂 (ml) 0 0 1.0
31、 5.0 1.0 1 10 1.0 5.0 1.0 2 20 1.0 5.0 1.0 3 30 1.0 5.0 1.0 4 40 1.0 5.0 1.0 5 50 1.0 5.0 1.0 6 60 1.0 5.0 1.0 A.5.2 样品的测定 DB33/T 4592003 8 A.5.2.1 待测酶液的制备 固体酶：根据样品酶活大小，称取 2g 10g 固体酶样，精确至 0.1mg，加入 40 200ml 蒸馏水，溶解后置 40oC 水浴浸提 30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度（使供试样液与空白液的吸光度之差落在 0.2-0.4 之间，下同） 。液体酶：精确量取
32、液体酶若干 ml，根据样品酶活力大小，直接用蒸馏水稀释至适宜浓度，待测。 A.5.2.2 测定程序 取三支 15150mm 试管（一支空白管，二支样品管） 。 分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液 1.0ml 。 将三支试管放入（ 40 0.2）oC 水浴中预热 5min，同时将测定底物（ 1%酪素溶液）置同一温度水浴中预热 5min。 分别向二支样品管中加入 1.0ml 1%酪素溶液，准确计时，反应 10min，取出。 迅速、准确向三支试管中加入 2ml TCL（沉淀试剂） ，于空白管中加入 1.0ml1%酪氨酸溶液，摇匀。将三支试管继续置（ 40 0.2）oC 水浴中放置 10min，
33、取出，迅速冷却至室温。 三支试管中反应液用滤纸（ Whatman1 号滤纸或新华 1 号滤纸）过滤。 另取三支 18 180mm 的试管（一支空白，二支样品管）分别吸取上述相应的滤出液 1.0ml，0.4mol/L 碳酸钠溶液 5.0ml，稀 Foiln 试剂 1.0ml，摇匀，置（ 40 0.2）oC 水浴中放置 20min，取出，迅速冷却至室温。 以空白管（对照）调仪器零点，在分光光度计波长 660nm 下，用 10mm 比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出生成的酪氨酸的含量。 A.6 酶活力计算 按照下式 (A.1)计算样品蛋白酶活力： A
34、 K V 4 N X1 (A.1) 1 W 10 式中： X1蛋白酶活力， u/g ； A样品与空白的的吸光度差 K比色常数； V样品提取时加入水的量（ ml） ； 4酶反应体系总体积（ ml） ； N样品二次稀释时的稀释倍数； 1参与反应的酶量（ ml） ； W样品重量（ g/ml） ； 10反应时间（ min） 。 A.7 精密度 同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的 10%。 DB33/T 4592003 9 附 录 B （规范性附录） 木聚糖酶活力的测定方法 B.1 原理 木聚糖酶在一定的温度和 pH 条件下，催化木聚糖水解生成二糖、木糖等还原糖。在碱性、煮沸条件下，能
35、将 3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，其颜色的深浅与还原糖（以木糖计）含量成正比。通过其在 550nm 测其吸光度，可得到还原糖生成量，计算出木聚糖酶的酶活力。以此代表木聚糖酶的总酶活力。 B.2 酶活单位定义 在（400.2）、pH 5.0条件下，在1min内水解木聚糖底物，产生相当于1微克木糖的还原糖的酶量，为1个酶活单位，以u/g(u/ml)表示。 B.3 试剂和溶液 除非另有规定，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。 B.3.1 1%（W/V）木聚糖底物 精确称取燕麦木聚糖 (xylan from Oat spelts, 美国 Sigma 公司 )1.
36、0000 g，溶于 80ml 蒸馏水中，水浴加热至溶解，冷却后转入 100 ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。此溶液在 4oC 冰箱贮存，有效期为3 天。 B.3.2 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液: 甲液：称取磷酸氢二钠（ Na2HPO4.2H2O ） 35.61 g, 用蒸馏水溶解，并定容至 1000ml。 乙液：称取柠檬酸（ C6H8O7.H2O） 21.01 g，用蒸馏水溶解，并定容至 1000ml。 . 使用溶液：取甲液 515ml，加乙液 485ml 混合均匀，用 pH 计校正至 pH 为（ 5.0 0.05） ,备用。 B.3.3 3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂: 取酒石酸钾钠 1
37、82g， 溶于 500ml 蒸馏水中， 加热。 于热溶液中依次加入 3,5-二硝基水杨酸 6.3g， 氢氧化钠 10g，苯酚 5g，无水亚硫酸钠 5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至 1000ml，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置 1 周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定 6 个月。 B.3.4 1%(W/V)木糖标准贮备溶液 称取预先于（ 1032）下干燥至恒重的木糖 1.0000 g，用蒸馏水溶解后定容至 100 ml，即为 1%浓度的木糖标准溶液。 B.3.5 木糖标准使用溶液 分别吸取 1%木糖标准贮备溶液 1.0ml、 2.0ml、 3.0ml、 4
38、.0ml、 5.0ml、 6.0ml 置 50ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成每 ml 分别含木糖 200 g、 400 g、 600 g、 800 g、 1000 g 、 1200 g 的标准使用溶液。 B.4 仪器和设备 除普通实验室仪器外，还应有： B.4.1 恒温水浴锅(400.2) oC。 B.4.2 分光光度计 B.4.3 酸度计 精度0.01pH 。 B.4.4 分析天平 感量0.1mg。 DB33/T 4592003 10 B.4.5 秒表或定时钟。 B.5 测定步骤 B.5.1 标准曲线的制作 按表 B.1，分别吸取标准木糖使用溶液、缓冲液和 DNS 试剂于各管中（每管号平平行 3 个样） ，混匀。 将标准管同时置于沸水浴中，反应 7min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水 10ml，混匀
