1、ICS 67120X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 213212007动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定免疫亲和一液相色谱法Determination of avermectins residues in foodstuffs of animal originImmunoaffinity。high performance liquid chromatograph2007-1 0-29发在 2008040 1实施宰瞀嬲鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅111前 言GBT 213212007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。
2、本标准起草单位：中国农业大学、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、李建成、曹兴元、王战辉、李晓薇、丁双阳、吴聪明、彭涛、国伟。动物源食品中阿维菌素类药物残留量的测定免疫亲和一液相色谱法GBT 2132120071范围本标准规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量检测的免疫亲和一液相色谱法。本标准适用于牛肝脏和牛肌肉组织样品中阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃普利诺菌素残留量的测定。本标准的方法检测限：阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃普利诺菌素均为1 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘
3、误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neq 1SO 3696：1987)3原理用甲醇提取试样中四种阿维菌素类药物，经免疫亲和色谱柱净化，用甲醇洗脱。洗脱液经氮气吹干，衍生化后，用高效液相色谱一荧光检测法测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43磷酸二氢钾。44氯化钾。45磷酸氢二钠(NazHPO。12H。O)。4
4、6氯化钠。47乙酸酐。48 1一一甲基咪唑：含量99。49埃普利诺菌素标准品：纯度98。410阿维菌素标准晶：纯度98。411 多拉菌素标准品：纯度943。412伊维菌素标准品：纯度98。413免疫亲和色谱柱(IAC柱)：长4 cm，内径1 cm，IAC凝胶体积为1 mL。414组织稀释液：001 molL磷酸盐缓冲液(pH 74)。称取磷酸二氢钾(43)0，2 g、氯化钾(44)02 g、磷酸氢二钠(45)29 g、氯化钠(46)88 g，用水溶解并稀释至1 L。415洗涤液：A液、B液和C液。A液为001 molL磷酸盐缓冲液(414)+甲醇(80+20，体积比)；B液为20甲醇溶液；C液
5、为50甲醇溶液。】GBT 213212007416衍生化A液：1一p甲基咪唑+乙腈(2+5，体积比)，现配现用。417衍生化B液：乙酸酐+乙腈(3+4，体积比)，现配现用。418埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准储备液：100-gmL。准确称取适量埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品(49412)，分别用乙腈配成100tgmL的标准储备液。一20保存六个月。419混合标准储备液：119mL。取四种标准储备液(418)各10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，4保存三个月。420标准工作液：分别量取适量上述混合标准储备液(419)，用乙腈稀释成浓度为1、
6、5、10、20、50、100和200 ngmL的系列标准溶液。5仪器51高效液相色谱仪：配荧光检测器。52组织匀浆机。53离心机。54旋转蒸发仪。55涡动仪。56氮吹仪。57恒温加热器。6试样制备与保存取新鲜或解冻的动物组织，剪碎，10 000 rmin匀浆1 min。-20 oc下保存。7分析步骤71提取称取试样1 g(精确到001 g)，于30 mL离心管中，加4 mL甲醇，涡动1 rain，300 rmin振荡30 min，3 000 rmin离心10 rain，取上清液。残渣用4 mL甲醇重复提取1次，合并两次提取液。72净化提取液中加20mL组织稀释液(414)，涡动混合均匀后，过I
7、AC柱，自然重力下流出，依次用洗涤液A液20mL、B液15mL和C液3mL(415)洗涤，用4mL甲醇洗脱于试管中，40氮气吹干。73衍生化试样残渣中加100 pL衍生化A液(416)，涡动05 rain，再加100 pL衍生化Bif(417)，涡动05 min，密闭，于96C恒温箱中衍生化反应100 rain。取出，冷却至室温。用乙腈稀释至25 mL，过02“m滤膜，进行HPLC分析。注：标准溶液经氮气吹干后同法进行衍生化操作。74测定741液相色谱条件色谱柱：C18，250 mmX46 mm，粒径5 Pm，或相当者。流动相：甲醇+水(97+3，体积比)。流速：1 mLmin。柱温：30。进
8、样量：20 pL。激发波长：365 nm。发射波长：475 llm。2GBT 2132120077。4。2液相色谱测定分别取适量衍生化后的试样液和标准工作液进行液相色谱测定，做单点校准或多点校准以色谱峰的峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中阿维菌素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样液测定过程中应参插标准工作液，以便准确定量。标准品液相色谱图见附录A。8结果计算按式(1)计算试样中阿维菌素类药物的含量。x一尘笪 m式中：x试样中阿维菌素类药物的残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c试样液色谱峰对应的阿维菌素类药物浓度，单位为微克每升(pgL)，稀释倍数；m试样质量，单位为克(g)。注：测定结果用平行测定后的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后两位。9精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数30。GBT 213212007附录A(资料性附录)色谱图EP一埃普利诺菌素AvM阿维菌素；DoR多拉菌素；M伊维菌素。图A1 2lL阿维菌素类药物的标准溶液色谱图
