1、ICS 67120X 04 圆园中华人民共和国国家标准GBT 213182007动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法2007-1 0-29发布Determination of nitroimidazoles residuesin foodstuffs of animal origin2008040 1实施丰瞀徽紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 再GBT 213182007本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科
2、学研究院。本标准主要起草人：荣会、牟峻、张代辉、林黎明、张鸿伟、马书民、赵庆松、李晓娟、彭涛。GBT 213182007引 言硝基咪唑类药物主要包括4一硝基咪唑、异丙硝唑、2一甲硝咪唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氯甲硝咪唑、地美硝唑、苯硝咪唑，是一类抗菌素和抗原虫药。硝基咪唑类药物在体内吸收快，所以标示残留物除了原形药物外，还包括代谢产物羟基甲硝唑MNzOH(甲硝唑代谢物)、羟甲基甲硝咪唑HMMNI(2一甲硝咪唑、洛硝哒唑代谢物)，它们具有损害细菌DNA和抗厌氧菌感染的功效。该类药物主要用于治疗和预防厌氧菌引起的局部或系统感染，抑制厌氧菌的DNA合成，也用于抗滴虫和阿米巴原虫等。由于硝基味唑类药物含有
3、的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性，从而导致此类药物有致癌作用和潜在的致畸作用。因此，硝基咪唑类药物在大多数国家为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物。本标准提供了动物源食品中硝基咪唑类及代谢物的高效液相色谱串联质谱多残留确证方法。动物源食品中硝基咪唑残留量检验方法GBT 2131820071范围本标准规定了动物源性食品中硝基咪唑原药8种、代谢产物2种残留量的高效液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾、鱼肉、奶粉、蜂蜜中；4一硝基咪唑、异丙硝唑、2一甲硝眯唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氯甲硝咪唑、地美硝唑、苯硝咪唑残留量及其代谢物羟基甲硝唑MNZOH(甲硝
4、唑代谢物)、羟甲基甲硝咪唑HMMNI(2一甲硝眯唑、洛硝哒唑代谢物)的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 1992，neq ISO 3696：1987)3原理样品中残留的8种硝基咪唑、2种代谢物用甲醇一丙酮均质或超声波提取，经乙酸乙酯液液分配，以凝胶色谱(GPC)净化，再经固相萃取(SPE)净化
5、，采用液相色谱串联质谱确证，外标法定量测定。4试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：HPLC级。42丙酮：HPLC级。43乙酸乙酯：HPLC级。44环己烷：HPLC级。45氯化钠。46无水硫酸钠：经650*2灼烧4 h，贮于密封容器中备用。47甲酸：优级纯。48饱和氯化钠水溶液。49硅藻土：80目120目。410 C，。固相萃取柱：10 g，6 mL。411微孔滤膜：有机系，045,um。412硝基咪唑原药8种、代谢产物2种标准物质：纯度均大于等于98(详见附录A)。413标准储备液：分别准确称取适量的每种标准物质，用甲醇配制成浓度为1 000
6、tgmL的标准储备液。该溶液应配制于棕色容量瓶中，在o4冰箱中可保存12个月。414混合中间标准溶液：分别准确移取一定体积的每种标准储备液，用甲醇稀释成适当浓度的混合中间标准溶液。该溶液应配制于棕色容量瓶中，在0。C4冰箱中可保存6个月。1GBT 213182007415混合标准工作溶液：分别准确移取一定体积的混合中间标准溶液，可根据需要用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作溶液。该溶液应配制于棕色容量瓶中，在0C4冰箱中可保存3个月。5仪器和设备51液相色谱一串联质谱仪：配电喷雾离子源串联四极杆检测器。52凝胶色谱仪：配有馏份收集浓缩器。53组织捣碎机。54均质器。55超声波发生器。S6旋转蒸发
7、器。57高速离心机。58氮吹仪。59具塞锥型瓶：250 mL。510分液漏斗：250 mL。511浓缩瓶：50 mL、250 mL。6试样制备与保存61肌肉组织及器脏组织类、水产品类从原始样品中取出有代表性样品(脏器应剔除筋膜)约500 g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于一18冷冻避光保存。62乳及乳制品类从原始样品中取出有代表性样品约500 g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于4。C冷藏避光保存。63蜂蜜从原始样品中取出有代表性样品约200 g，对无结晶的蜂蜜样品用组织捣
8、碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于4C冷藏避光保存；对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60C的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净的容器作为试样，密封并标明标记，将试样置于4冷藏避光保存。在融化时应注意防止水分挥发。在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化。7样品处理71提取711肌肉组织、脏器组织样品及水产品准确称取约20 g样品(精确至01 g)于250 mL具塞锥形瓶中，加入10 g硅藻：fi(49)与样品充分混匀，再依次加入5mL饱和氯化钠水溶液和70m
9、L甲醇一丙酮(3十1)，高速均质提取3rain。将提取液移人离心管中，于10 000 rmin条件下离心2 min，将上层提取液移人250 mL浓缩瓶中，残渣每次再用50 mL甲醇一丙酮(3+1)重复提取两次，合并提取液。712蜂蜜、乳及乳制品样品分别准确称取约20 g样品(精确至01 g)于250mL具塞锥形瓶中，加入10 mL饱和氯化钠水溶液和70 mL甲醇一丙酮(3+1)，超声波提取30 rain。移人离心管中，于10 000 rmin条件下离心2 min，2GBT 213182007将上层提取液移人250 mL浓缩瓶中。残渣每次再用50 mL甲醇一丙酮(3+1)重复提取两次，合并提取液
10、。72液液分配将711和712所得提取液于40(2水浴中旋转浓缩至只剩水相，并转移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL饱和氯化钠水溶液和25 mL乙酸乙酯，振摇3 min，静置分层，收集乙酸乙酯相。水相再用20 mL乙酸乙酯重复提取两次，合并乙酸乙酯相。经无水硫酸钠柱脱水，收集于250 mL浓缩瓶中，于40C水浴中旋转浓缩至近干，加入5 mL乙酸乙酯一环己烷(1+1)溶解残渣，并用045 pm滤膜过滤，待净化。73净化731凝胶色谱(GPC)净化7311凝胶色谱净化条件a)净化柱：700 mm25 mm，Bio Beads S-X3，或相当者；b) 流动相：乙酸乙酯一环己烷(1+1)；c)
11、流速：47 mLmin；d)样品定量环：50 mL；e)预淋洗体积：50 mL；f)洗脱总体积：210 mL；g)开始弃去体积：90 mL；h)收集体积：90 mL；i)最后弃去体积：30 mL。7312凝胶色谱净化步骤将5mL待净化液按7311规定的条件进行净化，合并馏份收集器中的收集液于250mL浓缩瓶中，于40C水浴中旋转浓缩至近干，加入5 mL甲醇以溶解残渣，待净化。732固相萃取(SPE)净化使用前用5 mL甲醇预淋洗c。固相萃取柱，将5 mL溶解液倾入C。固相萃取柱中，以1 mLmin速度收集流出液，再用10 mL甲醇进行洗脱。收集全部洗脱液于50 mL浓缩瓶中，于40(2水浴中旋
12、转浓缩至干。用甲醇溶解并定容至10 mL，经045 btm滤膜过滤后，供液相色谱串联质谱测定和确证。74混合基质标准溶液的制备741 肌肉组织殛脏器组织样品、水产品样品称取6份约20 g阴性试样(精确至01 g)于250 mL具塞锥形瓶中，加入5 mL饱和氯化钠水溶液和70 mL甲醇一丙酮(3+1)，高速均质提取3 min，于10000 rrain条件下离心2 min，弃去上层提取液。按照最终定容浓度0、10、20、50、100、500 ngmL分别加入混合中问标准溶液(414)或混合标准工作溶液(415)，余下操作同711、72、73。742蜂蜜、乳及乳制品样品称取6份约20 g阴性试样(精
13、确至01 g)于250 mL具塞锥形瓶中，按照最终定容浓度0、10、20、50、100、500 ngrnL分别加入混合中间标准溶液(414)或混合标准工作溶液(415)，余下操作同712、72、73。8测定81液相色谱条件a)流动相：见表1；b)进样量：10 pL。3GBT 213182007表1流动相条件时间min 流速(pLmin) 甲醇 o1甲酸水溶液000 250 130 870800 250 130 870810 250 400 600135 250 100 00019O 250 100 000191 250 130 870250 250 130 87082串联质谱条件参见附录B。8
14、3液相色谱串联质谱测定831定性测定对混合标准工作液及样液按上述规定的条件进行测定时，若检测样品的色谱峰保留时间与标准品一致，且与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。每种硝基眯唑的选择离子对的种类、相对丰度比见附录C。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50 20“50 1020 10允许的最大偏差 土20 士25 土30 土50832定量测定根据样液中被测8种硝基咪唑、2种代谢物的含量，选定浓度相近的标准工作溶液。标准工作溶液和待测样液中8种硝基咪唑、2种代谢物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。对混合标
15、准溶液与样液等体积分组分时段参插进样测定。外标法定量测定。在上述液相色谱串联质谱条件下，8种硝基咪唑、2种代谢物标准物质的保留时间见附录C，液相色谱串联质谱总离子流色谱图见附录D。84平行试验按照以上步骤对同一试样进行平行试验测定。85空白试验除不称取试样外，均按照以上步骤进行。9结果计算按式(1)进行计算：x。一瓮篙等等 式中：x，试样中硝基咪唑或代谢物i残留量，单位为微克每千克(pgkg)；A样液中硝基眯唑或代谢物i的峰面积(或峰高)；Ci标准工作液中硝基咪唑或代谢物i的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；A。标准工作液中硝基咪唑或代谢物i的峰面积(
16、或峰高)；m最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。计算结果需扣除空白值。10检出限(LOQ)本方法的测定低限见表3。GBT 213182007表3硝基咪唑原药8种、代谢物2种测定方法的测定低限及添加回收率范围测定低限和 回收率药物名称 确证低限(mgkg) 猪肉 猪肝 猪肾 牛肉 牛肝 牛肾 鸡肉 鸡肝 鱼肉 奶粉 蜂蜜722 714 747 775 736 754 795 727 823 774 7074一硝基眯唑 00011021 995 891 978 879 928 982 864 951 891 1042754 765 804 873 784 807 736 781 885 832
17、 724异丙硝唑 0000 51086 1028 1053 990 1147 982 997 1035 977 1076 1087771 739 762 758 725 740 717 718 796 748 6952一甲硝咪唑 0000 51132 1087 999 1116 1063 1001 975 1039 964 1080 1020744 728 753 725 713 742 787 730 768 744 733洛硝哒唑 0001971 1062 948 992 981 1115 959 1052 1126 1115 996778 735 775 754 731 748 822
18、752 809 759 729甲硝唑 0000 5983 1059 962 965 1032 1003 991 1077 970 1148 1035766 74O 789 797 767 769 803 736 823 730 702氧甲硝咪唑 0001958 983 1037 1173 954 1026 966 1028 962 1164 1113782 725 776 791 758 773 790- 763 847 745 723地美硝唑 0001969 1074 975 974 1005 957 948 1051 985 1112 1151746 7l_9 781 822 752 77
19、6 819 755 814 777 738-苯硝咪唑 0000 51094 1025 979 991 1136 944 993 983 963 1053 1068羟基甲硝唑 747 727 738 816 739 711 764 719 802 736 7300001(MNZOH) 977 1056 982 969 928 930 994 1126 1048 978 1084羟甲基甲硝755 740 751 839 776 805 778 724 780 751 701眯唑 00011125 1118 1054 1017 94O 967 1040 1015 1096 1007 966(HMMN
20、I)11回收率和精密度本方法对硝基咪唑原药8种、代谢物2种的添加回收率见表3。采用添加法，即对本底不含8种硝基咪唑原药及2种代谢物的猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾、鱼肉、奶粉、蜂蜜样品，添加分别为(o5)10、20、40 ngg水平的样品进行回收测定，每水平单独测定10次，相对标准偏差在4992241范围内。GBT 213182007附录A(资料性附录)8种硝基咪唑原药及2种代谢物的英文名、化学名、结构式表A1 8种硝基咪唑原药及2种代谢物的英文名、化学名、结构式相对分子序号 药物名称 英文名称 cAS号 分子式 结构式质量1 4一硝基咪唑 4一nitroimidazole 3
21、034386 C3H3N3 02 科审 11308-(32 异丙硝唑 ipronidazole 1488529 1 C7HN oz 埝， 169183 2一甲硝咪唑 2-methyl-5一nitroimidazole 88054222 CHsN30z 取 127108 H4 洛硝哒唑 ronidazole 7681-767 C6H8N404 N+填 20015岳 N。5 甲硝唑 metronidazole 443 481 C6H自N3q 氐尉 171158 Go“5-ehloro-1-methyl-4-nitroimid-6 氯甲硝咪唑 4897250 GH。CIN。O： 稍 16155azo
22、le7 地美硝唑 dimetridazole 551928 c5H7N302 吣取 14113，Nv气8 苯硝味唑 5一nitrobenzimidazole 94 52 O C7H5 N3 02 YL、从￥o 16314O-1(2-hydroxyethyl)2 hydroxy 0“羟基甲硝唑 methyl5一IIitmimidazole 。锣187159 4812-40-2 C6H9N3q(MNZOH) 2(2 hydroxymethyl_5 nitro-imidazole-1一y1)一ethanol 咚羟甲基甲硝 1-methyl-5-nitro-1H-imidazole10 咪唑 2-hy
23、droxymethyl 1 methyb5 936一05一O C5H7Mq 勺 15713(HMMNI) nitrcr-imidazole附录B(资料性附录)液相色谱串联质谱条件色谱柱：ZORBAX SBC150 mmX 21 mm，35 pm，或相当者柱温：30；电离方式：电喷雾(ESI)；扫描方式：正离子扫描，多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5 500 V；雾化气压力：021 MPa；气帘气压力：0088 MPa；辅助气压力：0062 MPa；离子源温度：550。GBT 213182007GBT 213182007附录C(资料性附录)8种硝基咪唑原药及2种代谢物的保留时间、选择监测离子设
24、定参数表”表C1 8种硝基咪唑原药及2种代谢物的保留时间、选择监测离子设定参数表保留时间 碰撞气能量 相对强度序号 药物名称 定量离子对 定性离子对 去簇电压VeV (基峰)1140679 23l 4一硝基咪唑 24 1140837 64 211140837 1918771233 182 羟基甲硝唑(MNZOH) 32 18771833 55 9518771262 251280419 423 2一甲硝咪唑 36 1280419 79 35128O816 2415781402 174 羟甲基甲硝咪唑(HMMNI) 43 l 5781402 50 251578551 2717201278 205
25、甲硝唑 49 1720817 59 801720817 3420111397 176 洛硝哒唑 55 2011548 59 192011548 341420959 247 地美硝唑 69 1420959 69 751420807 3616191158 258 氯甲硝眯唑 98 16191158 76 6616191448 2216391178 309 苯硝眯唑 100 16391178 74 301639909 5216951243 2510 异丙硝唑 151 16951243 65 9516951091 3581)所列参数是在API 4000质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。8 00e5500e5400e5300e5GBT 213182007附录D(资料性附录)8种硝基咪唑原药殛2种代谢物的液相色谱串联质谱总离子流色谱图2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24l4一硝基咪唑；2羟基甲硝唑(MNZOH)；32一甲硝咪唑；4羟甲基甲硝眯唑(HMMNI)；5甲硝唑；6洛硝哒唑；7地美硝唑；8氯甲硝咪唑9苯硝咪唑；10异丙硝唑。图D1 8种硝基咪唑原药及2种代谢物的液相色谱串联质谱总离子流色谱图9
