1、中华人民共和出入境检验检疫行标准出k. SN/3767.17-2014 食品中转基因成分环介导温扩增(LAMP)检测方法17部分;大豆DP356043晶系Loop-mediated isothe口nalamplification detecion method for genetically modified components in food for export-Part 17: Soybean DP356043 2014-01-13发布2014-08-01实施中产华人民共和自发布E国家质量监督脸验检茂总局SN/T 3767.17-2014 目USN/T 3767(出口食品中转基因成分环
2、介导等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18
3、部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第17部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认
4、证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国中山出入境检验检疫SN/T 3767.17-2014 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:冯家望、唐食明、曾静、李志勇、)彼珊、王小玉、胡松楠、游淑珠、刘李登、陈敬、常彦磊。H 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第17部分:大豆DP356043品系SN/T 3767.17-2014 SN/T 3767的本部分规定了大豆及其加工产品中转基因大豆DP356043品系特异性的环介导等温扩增CL
5、AMP)筛选检测方法。本部分适用于大豆及其制F餐露罄蹬蟹絮絮婴建毅赣擎的定性检测。本方法的定性检测低限为2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室GB/T 19495.2 转基因产GB/T 19495.3 转基因产CRL VL04/07VR 大豆quantification of soybean 3 防污染措施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理量PCRC specific method
6、for the 根据转基因大豆DP356043品系外源基因和大豆边界序列设计特异性内引物和外引物各一对或者SNjT 3767.17-2014 添加一条或一对环引物，特异性目标序列和i引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序歹Lt的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核背酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成.在同一链上互补序列周而复始形成有很多坏的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应榕液中的Mg2结合，产生副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在反应?昆合体系中不应存在DN
7、A聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时.随着双链DNA的增加.SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0C :t 0.5 C和8
8、0.0C士0.5C。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5L10 f1L;量程10fJ-L 100L;量程100，_lL 1 000L。6.2.5 -十时器。6.3 试剂和材料除另有规定外.所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核昔酸浓度10mmol/L , 6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f1 L , 6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L TrisHCl C pH值为8.8)、100m
9、mol/L硫酸镜、100 mmol/L氧化押、20mmol/L硫酸镜、1%Triton X一100。6.3.5 硫酸镜溶被:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5 mol/L, 6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米Bt-ll品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2.环引物1和环引物2。2 外寻i物扩增片段长度:244 bp 夕卡引物1CF3 , 5 -3 ) : GCCA T AACCTCA TCTCGC 夕卡寻|斗1J2CB3 ,5 -3): TGGTCTTCTGAGACTGTA
10、TCTT 内引物1CFIP，5-3):AGCCTATTCGACCTAACGACCTATACTAGAGCCATCGTAGGAG 内引物2CBIP.5-3): ACTAAGGCCGCTCTAGAGATCCATTCTTGGAGTAGACGAGAGT 环引物1CFLP，5-3):AAGTCGATCGGTCAAGAATCC 环引物2CBLP，5-3):TCAACATGGTGGAGCACG SN/T 3767.17-2014 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4. 1. 1 阴性对照:采用不含有待y11J基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 1;日性又才照:采用
11、含有待Y!基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒D兴A代替DNA模板。6.4. 1. 3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA容解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内惊基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA，可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 大豆DP356043品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全力n入反应液中.不要帖附于管壁上。在
12、反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心.防止显色t11昆合进入反应液中。组分ThermoPol缓冲液外引物1(F3) 夕|、寻|物2CB3)内引物1(FIP) 内引物2(BIP) vf、引物l(FLP)环引物2(BLP)dNTPs 甜菜碱硫酸续Bs/ DNA聚合酶D:-JA模板7)( 表1大豆DP356043品系LAMP反应体系工作液浓度力日样量/L10 2. 5 10 f1 mol/L O. 5 10/imol/L O. 5 40mol/L 1. 0 40mol/L 1. 0 20mol/L 1. 0 20 /imol/L 1. 0 10 mmol/L 5 mol/L
13、4 150 mmol/L l 8 U/iL 100 ng/L 2 补足至25.0 反应体系终浓度0.2 /imol/L 0.2 /imol/L 1. 6 f1 mol/L 1.6口1ol/L0.8 /imol/L O. 8 f1 mol/L 1. 6 mmol/L 0.8 mol/L 6 mmol/L 0.32 U/f1 L 8 ngrL 什。SN/T 3767.17-2014 6.4.4 LAMP反应参数63.0 oc土0.5oc恒温扩增90min, 80.0 oc士0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进
14、行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实6.5.2 6.5.3 阴性对照:反应管中液6.5.4 阳性对照:反应管中液7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述8.2 检测结果为转基因大豆4 测;实验对照结果正常，可判断该样品证(见附录A): 验情况进行结果判断和表述。SN/T 3767.17-2014 附录A (资料性附录)转基因大豆DP356043品系基因序列A.1 转基因大豆DP356043品系
15、外源基因和大豆边界序列70 GCCATAACCTCATCTCGCCTTCCACCGCACCAGCAAGAGGAAACCGAATTAGAGCTGAAA 310 A A.2 引物喊基FF3: GCCATAACCTCATCTCG B3: TGGTCTTCTGAGACTGTiATCTT F1c F2 FIP , AGCCT A TTCG ACCT AAefrACeTATAGT AGAGGAqGGTAGGAG BIP , 5 ZON|巳.hh肉同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第17部分:大豆DP356043晶系SN/T 3767.17-2014 7: 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里回街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷.x 开本880X12301/16 印张0.75字数10千字2014年12月第一版2014年12月第一次印刷印数1-1300 定价16.00元1(-书号:155066.2-27471 SN/T 3767.17一2014
