1、ICS 07.100.30 C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 4789.30-2008 代替GB/T4789.30-2003 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验2008-11-21发布Microbiological examination of food hygiene一Examination of Listeria monocytogenes 中华人民共和国卫生部俗世中国国家标准化管理委员会.oc.11.1 2009-03-01实施GB/T 4789.30-2008 目。吕本标准的第一法修改采用美国FDA(细菌性检验手册)(Bacteriological analytic
2、al man ual , Chapter 10，2002);第二法等同采用国际分析家学会的单核细胞增生李斯特氏菌检验方法)(AOAC-RI Per formance tested methods VIDAS Listerimonocytogenes Test, 999. 06) ;第三法等同采用国际分析家学会的单核细胞增生李斯特氏菌检验方法)(AOACInternational Official Method 2003.12 , BAX Liste ria monocytogenes)。本标准的第一法与美国FDA/BAM方法相比主要区别如下:一一增菌培养基以LB肉汤替代了BLEB肉汤;一一一选
3、择性分离培养基以PALCAM代替了OXA，增加了CHROMagarListeria显色培养基;一二增加了初筛步骤;一一培养温度以36oc士1oc代替35oc。本标准代替GB/T4789. 30-2003(食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验。本标准与GB/T4789. 30-2003相比主要修改如下:一删除了规范性引用文件。一一-修改了第一法。包括选择性分离培养基以PALCAM代替了MMA，增加了CHROMagarListeria显色培养基;增加了初筛步骤;删除了尿素酶试验和硝酸盐还原试验。一一增加了第二法，全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法。-一一增加了第三法，全自动病原菌检测系统筛选
4、法。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准参加起草单位:福建省疾病预防控制中心、陕西省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心。本标准主要起草人:刘秀梅、杨洋、陈伟伟、郭云昌、田静、马国柱、马戈。本标准所代替标准的历年版本发布情况为z一一-GB/T4789. 30-1994, GB/T 4789.30-2003。I GB/T 4789.30-2008 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1 范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriam
5、onocytogenes)的检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规元菌及培养设备外，其他设备和材料如下z2. 1 冰箱:2oC-S oC。2.2 恒温培养箱:30 oC :f: 1 oC、36oC士1oC。2.3 均质器。2.4 显微镜:10X-100X。2.5 电子天平:感量O.1 go 2.6 锥形瓶:100mL、500mL。2. 7 元菌吸管:1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。2.8 元菌平皿:直径90mmo 2.9 元菌试管:16 mmX 160 mm。2.10 离心管:30mmX100
6、mm。2. 11 元菌注射器:1mLo 2.12 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。2. 13 马红球菌(Rhodococcusequi)。2. 14 小白鼠:16g ,._, 18 g。2. 15 全自动微生物鉴定系统(VITEK户。2.16 全自动酶联荧光免疫分析仪(miniVIDAS或VIDAS)1)。2. 17 全自动病原菌检测系统(BAX系统，包含BAX系统Q7)2)。3 培养基和试剂3. 1 含0.6%酵母浸膏的膜酷豚大豆肉汤(TSB-YE):见第A.1章。3.2 含0.6%酵母浸膏的膜酷豚大豆琼脂(TSA-YE):见第A.2章。3.3 李氏增菌肉汤LB(LB1，LBz):见第
7、A.3章。3.4 1%盐酸口丫院黄(acriflavineHCl)溶液z见A.3. 2.10 3.5 1%荼睫酣酸铀盐(naladixicacid)溶液:见A.3. 2.1。3.6 PALCAM琼脂z见第A.4章。3. 7 革兰氏染色液z见第A.S章。1) 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2) 由美国杜邦公司提供的产品的商品名，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。GB/T 4789.30-
8、2008 3.8 SIM动力培养基z见第A.6章。3.9 缓冲葡萄糖蛋白陈水甲基红(MR)和平P试验用:见第A.7章。3. 10 5 % -8 %羊血琼脂z见第A.8章。3. 11 糖发酵管:见第A.9章。3. 12 过氧化氢酶试验:见第A.10章。3. 13 科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂3)。3. 14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒或VITEK-GPI鉴定卡1)。第一法常规培养方法4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图105 操作步骤5. 1 增菌检样25 g(或25mL)样品+LBl增菌-液225mL.均质3o c士1c, 24 h o. 1 mL+ 10 mL
9、LB2增菌液30 c士1C, 18 h-24 h 科玛嘉李斯特菌显色培养基接种木糖、鼠李糖，36 c士1.C , 24 h;同时于TSA-YE平板划线纯化，30 c士1C, 24 h-48 h 图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序以无菌操作取样品25g(或25mL)加入到含有225mL LB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min- 2 min;或放入盛有225mL LB1增菌液的均质杯中，8000 r/min-10 000 r/min均质1min- 2 min。于30oC :f: 1 oC培养24h，移取0.1mL，转种于10mL LBz增菌液内，于300C士1oC 2 3) 由法
10、国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。培养18h,., 24 ho 5.2 分离GB/T 4789.30-2008 取LB2二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂平板上，于36oC :I: 1 oc培养24h,., 48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在科玛嘉李斯特氏菌显色琼脂平板上为小的困形蓝色菌落，周围有白色晕圈;在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。5.3 初筛自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上
11、典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36oC士1 oC培养24h;同时在TSA-YE平板上划线纯化，于300C土1oC培养24h,., 48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。5.4 鉴定5.4.1 染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为(0.4m0.5m)X (0.5m，.，2.0m); 用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。5.4.2 动力试验:李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。5.4.3 生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验
12、。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表10表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖MR-VP 甘露醇鼠李糖木糖七叶昔单核细胞增生李斯特氏菌+ 十(L. monocytogenes) 十十/十+ + 格氏李斯特氏菌+ 十十/十+ + (L. grayi) 斯氏李斯特氏菌+ + 十+/+ 十十(L. seeligeri) 威氏李斯特氏菌十十(L. welshimeri) +/+ V 十+ 伊氏李斯特氏菌+ + 十十/+ 十(L. ivanovii) 英诺克李斯特氏菌+ + +/十V 十(L. innocua) 注:十阳性;一阴性;V反应不定。5.4.4
13、溶血试验:将羊血琼脂平板底面划分为20个，._，25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36oC士1oC 培养24h,., 48 h，于明亮处观察，单核细胞增生李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌元溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。5.4.5 协同溶血试验(cAMP):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂
14、直线两端不要触及平行线，于30oC士1oC培养24 h,., 48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的G/T 4789.30-2008 溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。5.5 生化鉴定系统可选择APIListeria 10300生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统对5.3中3个，_，5个纯培养的可疑菌落进行鉴定。5.6 小鼠毒力试验(可选择)将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于300C士1oC培养24h , 4 000 r/min离心5min, 弃上清液，用元菌生理盐水制备成浓度为10
15、10CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2d ,_, 5 d内死亡。试验时可用已知菌做对照。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。5. 7 结果报告综合以上生化试验和溶血试验的结果，报告25g(或25mL)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。第二法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法6 原理mini VIDAS或VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌分析，是在自动VIDAS仪器上进行的双抗体夹心酶联荧光免疫分析方法。固相容器(SPR)用抗单核细胞增生李斯特氏菌抗体包被，各种试剂均封闭在试剂条内。煮沸过的增菌肉汤加入试条孔
16、后，在特定时间内样本中的单核细胞增生李斯特氏菌抗原与包被在SPR内部的单核细胞增生李斯特氏菌抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体与固定在SPR壁上的单核细胞增生李斯特氏菌抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。SPR中所用荧光底物为磷酸4-甲基伞型物。结合在SPR壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物:4-甲基伞形酣。VIDAS光扫描器在波长450nm处检测该荧光强度。试验完成后由VIDAS自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样本的检测结果。7 设备和材料mini VIDAS或VIDAS。8 试剂8.1 LM02试剂条。8.2 校正液:纯化灭活的单核细胞增生李斯特
17、氏菌抗原标准溶液。8.3 阳性对照。8.4 阴性对照。8.5 MLE卡。9 操作步骤9. 1 前增菌以无菌操作取样品25g(或25mL)加入到含有225mL Demi-Fraser肉汤的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min_ 2 min;或放入盛有225mL Demi-Fraser肉汤的均质杯中，8000 r/min_ 10 000 r/min均质1min,-.; 2 min。于300C士1oC培养24h。同时做阳性及阴性对照。9.2 增菌与处理取1mL前增菌液接种于10mL Fraser肉汤，于300C士1oC培养24h，取1mL增菌液加入试管中，100oC水浴15min。剩余增菌液保
18、存于2oC ,-.; 5 oC，以备对阳性检测结果进行确认。GB/T 4789.30-2008 9.3 上机操作9.3.1 输入MLE卡信息每个试剂盒在使用之前，首先要用试剂盒中的MLE卡向仪器输入试剂规格(或曲线数据)。每盒试剂只需输入一次。9.3.2 校正在输人MLE卡信息后，使用试剂盒内的校正液进行校正，校正必须做双份测试。以后每14天进行一次校正。9.3.3 检测取出试剂条，待恢复至室温后进行样本编号。建立worklist，输入样本编号。分别吸取500L对照和样本(冷却至室温)加入到试剂条样本孔中央。依屏幕提示，将试剂条放人仪器相应的位置。所有分析过程均由仪器自动完成，检测约需45mi
19、no 9.4 结果报告9.4.1 检测值(x)是样品的相对荧光值(RFV1)与标准溶液的相对荧光值(RFV2)的比值，见式(1)。x ppv =一一y1 .( 1 ) RFV2 若检测值0.05，则检测结果为阴性;检测值二三0.05，则检测结果为阳性。9.4.2 检测结果阴性，可直接报告25g(或25mL)样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。检测结果阳性的样品，应按照5.2 r-.J 5. 4对保存于2oC ,., 5 oC的增菌液进行确认并报告。第三法全自动病原菌检测系统筛选法10 原理BAX系统或BAX系统Q7利用多聚酶链反应(PCR)来扩增并检测细菌DNA中特异片段来判断目标菌是否存在。
20、反应所需的引物、DNA聚合酶和核昔酸等被合并成为一个稳定、干燥的片剂，并装人PCR管中，检测系统运用荧光检测来分析PCR产物。每个PCR试剂片都包含有荧光染料，该染料能结合双链DNA，并且受光激发后发出荧光信号。在检测过程中，BAX系统通过测量荧光信号的变化，分析测量数据，从而判定阳性或阴性结果。门设备和材料11. 1 系统主机及工作站。11. 2 加热槽。11. 3 冷却槽。12 试剂12.1 BAX单核细胞增生李斯特氏菌检测试剂盒12. 1. 1 裂解缓冲液。12. 1. 2 蛋白酶。12. 1. 3 带药片的PCR管。12. 1. 4 透明盖。12.2 溶菌试剂见第A.l1章。5 GB/
21、T 4789.30-2008 12.3 李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(bufferedListeria enrichment broth,BLEB) 见第A.12章。12.4 丙磺酸铀-李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(MOPS-bufferedListeria enrichment broth,MOPS-BLEB) 见第A.13章。12.5 半量FRASER肉汤(demi-Fraser) 见第A.14章。12.6 UVM李斯特氏菌增菌肉汤(UVMListeria Enrichment Broth, UVM-LEB ) 见第A.15章。12. 7 李斯特氏菌增菌肉汤(Listeriaenrichment br
22、oth, LEB) 见第A.16章。13 操作步骤13. 1 增菌13. 1. 1 生肉:称取25g样品于225mL demi-Fraser肉汤中，均质后，30aC士1ac培养22h,_, 24 h;移取100L转种于9.9 mL MOPS-BLEB中，36aC士1ac培养18h,_, 24 h。13. 1. 2 熟肉制品:称取25g样品于225mL UVM-LEB中，均质后，30aC士1ac培养22h,_, 24 h;移取100L转种于9.9mL MOP卡BLEB中，36oc士1oc培养18h,_, 24 h。13. 1.3 乳品:称取25g样品于225mL LEB中，均质后，在360C土1
23、oc培养22h ,_, 26 h;移取1mL转种于9mL MOPS-BLEB中，36oc士1oc培养18h,_, 24 h。13. 1. 4 熏鱼:称取25g样品于225mL LBl中，均质后，36oc士1oc培养22h,_, 26 h;移取1mL转种于9mL MOPS-BLEB中，36oc士1oc培养18h,_, 24 h。13. 1. 5 其他食品:称取25g(或25mL)样品于225mL不含抗生素的BLEB中，均质后，在30oc士1 oc培养4h，然后加人抗生素在30oc士1oc培养20h，移取100L转种于9.9mL MOPBLEB中，36 oc士1c培养18h,_, 24 h。13.
24、2 上机操作13.2. 1 打开加热槽分别加热至55oc和95OC，检查冷藏过夜的冷却槽(4OC)，开机并启动BAX系统软件。如果仪器自检后建议校正，按屏幕提示进行校正操作。13.2.2 创建rack文件z根据提示在完整的rack文件和个样资料中输入样品信息。13.2.3 溶菌操作:在每个溶菌管加入200L配制好的溶菌试剂，取5L增菌肉汤加入相应的溶菌管中，盖上盖子。将溶菌管放在55c加热槽中，加热60min;再将溶菌管转移到在95oc的加热槽中，加热10min;最后将溶菌管转移到冷却槽上(冷却槽从冰箱取出后30min内使用完毕)，冷却5mino剩余增菌肉汤保存于2oC ,_, 8 oC，以备
25、对阳性检测结果确认。13.2.4 加热循环仪/检测仪:从菜单中选择RUNFULL PROCESS ，加热到设定温度(加热槽90OC , 盖子100OC)。13.2.5 溶菌产物转移=将PCR管支架放到专用冷却槽上，然后将带药片的PCR管放入到支架内。将所有的管盖放松并除去一排管盖。用多道加样器将50L溶菌产物加人此排管中，并用替代的透明盖密封PCR管。换用新吸头，重复上述操作，直至将所有样品转人带药片的PCR管中。13.2.6 扩增和检测:按PCRWizard的屏幕提示，将加完样的PCR管放入PCR仪/检测仪中开始扩增。全过程(扩增和检测需要大约3.5 h。当检测完成后，PCRWizard提示
26、取出样品，并自动显示结果。13.3 结果报告6 绿色一表示阴性结果。红色十表示阳性结果。GB/T 4789.30-2008 黄色?表示不确定结果。黄色俨表示错误结果。13.3. 1 不确定或错误结果，对保存于2oC ,_, 5 oC的增菌液重新上机检测。13.3.2 检测结果阴性，可直接报告25g(或25mL)样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。13.3.3 检测结果阳性的样品，应按照5.2,_, 5. 4对保存于2oC ,_, 5 oC的增菌液进行确认并报告。7 GB/T 4789.30-2008 附录A(规范性附录)培养基和试剂A.1 含0.6%酵母浸膏的膜酷陈大豆肉汤(TSB-YE)A.
27、 1. 1 成分膜陈多价陈酵母膏氯化纳磷酸氢二饵葡萄糖蒸馆水A. 1.2 制法17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0g 2.5 g 2.5 g 1 000 mL 将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2-7.4，分装，121oc高压灭菌15min，备用。A.2 含0.6%酵母膏的膜酷陈大豆琼脂(TSA-YE)A. 2.1 成分膜豚多价陈酵母膏氯化铀磷酸氢二饵葡萄糖琼脂蒸馆水A.2.2 制法17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 15.0 g 1 000 mL 将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2-7.4，分装，121oc高压灭菌15min，备用。A.
28、3 李氏增菌肉汤(LB1，LB2)A. 3.1 成分膜豚多价陈酵母膏氯化锅磷酸二氢饵磷酸氢二锅七叶昔蒸馆水A. 3. 2 制法5.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 1. 4g 12.0 g 1. 0g 1 000 mL 将上述成分加热溶解，调pH至7.2-7.4，分装，121oc高压灭菌15min，备用。8 A. 3. 2.1 李氏I液(LB1)225 mL中加入:1%茶睫酣酸用0.05mol/L氢氧化纳溶液配制)0.5 mL 1%叮咬黄(用元菌蒸馆水配制)0.3 mL A. 3. 2. 2 李氏E液(LB2)200mL中加入:1%荼院酣酸0.4 mL 1%叮咬黄0.5 mL A.
29、4 PALCAM琼脂A. 4.1 成分酵母膏葡萄糖七叶昔拧棱酸铁镀甘露醇盼红氯化钮酷蛋白膜酶消化物心膜酶消化物玉米淀粉肉胃酶消化物氯化销琼脂蒸馆水A.4.2 制法8.0 g 0.5 g 0.8 g 0.5 g 10.0 g O. 1 g 15.0 g 10.0 g 3.0 g 1. 0g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 1 000 mL G/T 4789.30-2008 将上述成分加热溶解，调pH至7.2，_7.4，分装，121oc高压灭菌15min，备用。A. 4. 2. 1 PALCAM选择性添加剂多粘菌素B5.0 mg 盐酸日丫皖黄2.5 mg 头抱他院10.0 mg 元菌蒸馆水5
30、00 mL A.4.2.2 制法将PALCAM基础培养基溶化后冷却到50OC，加人2mL PALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒在元菌的平皿中，备用。A.5 草兰氏染色液A.5.1 结晶紫染色液A.5. 1. 1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液A.5. 1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。1. 0g 20.0 mL 80.0 mL 9 G/T 4789.30-2008 A.5.2 革兰氏破液A. 5. 2.1 成分殃殃化饵蒸馆水A.5.2.2 制法1. 0g 2.0 g 300.0 mL 将腆与殃化饵先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至3
31、00mL。A.5.3 沙黄复染液A. 5. 3.1 成分沙黄95%乙醇蒸馆水A. 5. 3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A. 5. 4 染色法0.25 g 10.0 mL 90.0 mL A. 5. 4.1 将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.5.4.2 滴加革兰氏棋液，作用1min，水洗。A.5.4.3 滴加95%乙醇脱色，约15s.30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4 滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。A.6 SIM动力培养基A.6.1 成分膜陈多价陈硫酸铁钱硫代硫酸铀琼脂蒸馆水A.6.2 制
32、法20.0 g 6.0 g 0.2 g 0.2 g 3.5 g 1 000 mL 将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，121ac高压灭菌15min，备用。A.6.3 试验方法挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中，于30ac培养24h,._,48 h，观察结果。A.7 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和平P试验用)A. 7.1 成分多陈葡萄糖磷酸氢二饵蒸馆水A.7.2 制法7.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000 mL 溶化后校正pH7.0，分装试管，每管1mL, 121 ac高压灭菌15min，备用。10 A. 7.3 甲基红(MR)试验A. 7. 3.1 甲基红试剂成分
33、甲基红95%乙醇蒸馆水A. 7. 3. 2 制法10 mg 30 mL 20 mL 10 mg甲基红溶于30mL 95 %乙醇中，然后加入20mL蒸馆水。A. 7. 3.3 试验方法GB/T 4789.30-2008 取适量琼脂培养物接种于本培养基，36oC :f: 1 oC培养2d-5 do滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A. 7. 4 v-p试验A.7.4.1 6%岱荼盼，乙醇溶液成分及制法:取-荼酣6.0g，加元水乙醇溶解，定容至100mL。A.7.4.2 40%氢氧化饵溶液成分及制法:取氢氧化饵40g，加蒸馆水溶解，定容至100mLo A. 7. 4.3 试
34、验方法取适量琼脂培养物接种于本培养基，360C士1oC培养2d-4d。加入6%-茶酷-乙醇溶液0.5mL 和40%氢氧化饵溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在360C士1oC继续培养4h再进行观察。A.8 血琼脂A. 8.1 成分蛋白陈牛肉膏氯化锅琼脂蒸馆水脱纤维羊血A.8.2 制法1. 0g 0.3 g 0.5 g 1. 5g 100 mL 5 mL-10 mL 除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121oC高压灭菌15min，冷至U50 oC，以无菌操作加入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。A.9 糖发酵管A.9.1 成分牛肉膏蛋白豚
35、氯化销磷酸氢二锅(Na2HP04 12H20) 0.2%澳靡香草盼蓝溶液蒸馆水A. 9. 2 制法5.0 g 10.0 g 3.0 g 2.0 g 12.0 mL 1 000 mL A. 9. 2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，pH7.4，1150C高压灭菌15min，备用。11 GB/T 4789.30-2008 A. 9. 2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL, 115 oc高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。A.9
36、.3 试验方法取适量纯培养物接种于糖发酵管，36oC :i: 1 oC培养24h-48 h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳性。A.10 过氧化氢酶试验A. 10. 1 试剂3%过氧化氢溶液:临用时配制。A. 10.2 试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。A. 10.3 结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。A.11 溶菌试剂A. 11. 1 成分蛋白酶裂解缓冲液A. 11. 2 制法150.0L 12.0 mL 将150.0L蛋白酶加入1瓶12.0mL的裂解缓冲液中。将准备日期标记在瓶上，储存在20C-.，8 oC，
37、在两周内使用。A.12 李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(bufferedListeria enrichment broth,BLEB) A. 12. 1 成分膜酷陈大豆粉酵母膏磷酸氢二饵磷酸氢二纳荼睫酣酸放线菌酣盐酸叮咬黄素A. 12.2 制法3.0 g 6.0 g 1. 4g 9.6 g 40.0 mg/L 50.0 mg/L 15.0 mg/L 将各组分混合，不加人抗生素，调节pH到7.3:i: 0. 2 , 121 oC高压灭菌15min。用元菌水分别制备0.5%(质量浓度)的叮咬黄素溶液和荼陡酣酸溶液，用40%(体积分数)的酒精制备1%的(质量浓度)放线菌酣溶液。过滤除菌后，分别取3mL叮咬黄
38、素溶液、8mL茶院酣酸溶液和5mL放线菌酣溶液加入到1000 mL培养基中。A.13 丙磺酸铀-李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(MOPS-bufferedListeria enrichment broth ,MOPS-BLEB) A. 13. 1 成分膜酷陈大豆粉3-(N-吗琳代丙磺酸3-(N-吗琳代丙磺酸纳12 3.0 g 6.7 g 10.5 g GB/T 4789.30-2008 酵母膏荼皖酣酸放线菌酣盐酸盯睫黄素蒸馆水A. 13.2 制法6.0 g 40.0 mg/L 50.0 mg/L 15.0 mg/L 1 000 mL 将各组分混合，不加入抗生素，调节pH到7.3士o.2 ,121 oc
39、高压灭菌15min。用元菌水分别制备0.5%(质量浓度)的盯院黄素溶液和荼皖酣酸溶液，用40%(体积分数的酒精溶液制备1%的(质量浓度)放线菌酣溶液。过滤除菌后，分别取3mL口丫院黄素溶液、8mL茶皖酣酸溶液和5mL放线菌酣溶液加入到1000 mL培养基中。A.14 半量Fraser(Demi-Fraser)肉汤和Fraser肉汤A. 14. 1 基础培养基A. 14. 1. 1 成分蛋白豚膜蛋白豚酵母膏牛肉膏氯化铀磷酸氢二锅磷酸氢二饵氯化鲤七叶昔蒸馆水A. 14. 1. 2 制法5.0 g 5.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 12.0 g 1. 4g 3.0 g 1. 0g 1
40、 000 mL 将各组份混合，调节pH到7.2士0.2，121oc高压灭菌15mino A. 14.2 抗生素溶液的配制用蒸馆水分别制备0.5%(质量浓度)的盐酸日丫皖黄素溶液和荼睫酣酸溶液，过滤除菌。A. 14.3 完全培养基A. 14.3. 1 半量Fraser肉汤分别取3.2mL盐酸盯院黄素溶液、8mL荼咬酣酸溶液加入到1000 mL基础培养基中。A. 14.3.2 Fraser肉汤分别取6.4mL盐酸叮咬黄素溶液、16mL茶院酣酸溶液加入到1000 mL基础培养基中。A.15 UVM李斯特氏菌增菌肉汤(UVMListeria Enrichment Broth, UVM-LEB ) A.
41、 15. 1 成分蛋白豚5.0 g 膜蛋白豚5.0 g 牛肉膏5.0 g 酵母膏5.0 g 氯化铀20.0 g 磷酸二氢饵1. 4g 磷酸氢二铀12.0 g 13 GB/T 4789.30-2008 七叶昔茶院酣酸盐酸盯脆黄素蒸馆水A. 15.2 制法1. 0g 20.0 mg/L 12.0 mg/L 1 000 mL 将各组分混合，不加人抗生素，调节pH到7.3土0.2，121oc高压灭菌15min。用元菌水分别制备0.5% (质量浓度)的叮咬黄素溶液和荼皖酣酸溶液，过滤除菌后。分别取3 mL盯院黄素溶液、8mL荼院酣酸溶液加入到1000 mL培养基中。A.16 李斯特氏菌增菌肉汤(List
42、eriaEnrichment Broth,LEB) A. 16.1 成分膜肪、多价豚酵母膏氯化铀磷酸氢二饵葡萄糖蒸馆水盐酸口丫睫黄素茶院酣酸A. 16.2 制法17.0 g 3.0 g 6.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 1 000 mL 15.0 mg/L 40.0 mg/L 将各组分混合，不加入抗生素，调节pH到7.3土0.2，121oc高压灭菌15min。用元菌水分别制备0.5%(质量浓度的盯院黄素溶液和秦晓酣酸溶液，过滤除菌后。分别取3mL 叮咬黄素溶液、8mL荼皖酣酸溶液加入到1000 mL培养基中。14 OONlggh寸同筒。华人民共和国家标准食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T 4789.30一2008国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数29千字2009年3月第一次印刷开本880X12301/16 2009年3月第一版骨书号:155066 1-36035定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 4789.30-2008
