1、ICS 13300；1302040A 80 圆圄中华人民共和国国家标准GBT 2 1 802-2008化学品 快速生物降解性改进的MITI试验(I)Chemicals-Ready biodegradability-Modified MITI test(I)2008-05-12发布 2008090 1实施宰瞀鹃紫瓣訾麟赞篓发布中国国家标准化管理委员会促19刖 置GBT 21802-2008本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No301C(1992年)改进的MITI(I)试验(英文版)。本标准做了下列编辑性修改：将计量单位改为我国法定计量单位。本标准的附录A、附录B和附录C为
2、资料性附录。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SACTC 251)提出并归口。本标准负责起草单位：环境保护部化学品登记中心。本标准参加起草单位：环境保护部南京环境科学研究所、上海市检测中心、沈阳化工研究院安全评价中心。本标准主要起草人：杨力、刘纯新、高映新、单正军、刘济宁、陈晓倩、丁琦。化学品快速生物降解性改进的MITI试验(I)GBT 21802-20081范围本标准规定了化学品快速生物降解性改进的MITI试验(I)的方法概述、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本标准适用于可溶于水的或难溶于水的、吸附性、易挥发或非挥发性化学品的快速生物降解性。2术语和定义下列术语
3、和定义适用于本标准。21快速生物降解性ready biodegradability受试物在限定时间内与接种物接触表现出的生物降解能力。22初级生物降解primary biodegradation受试物在生物作用下化学结构发生变化致使特性丧失的过程。23溶解性有机碳dissolved organic carbon，DOC溶液中有机碳的含量，通常指通过045 pm滤膜过滤后液体中的有机碳含量，或经4 000 rrain转速离心15 rain后上清液中的有机碳含量。24生化需氧量biochemical oxygen demand，BOD微生物分解有机物所消耗氧的量，可表示为每毫克受试物消耗的氧气毫克
4、数(ragrag)。25理论需氧量theoretical oxygen demand，ThOD根据分子式计算得到的受试物完全被氧化需要的氧的总量，可表示为每毫克受试物消耗的氧气毫克数(mgmg)。26停滞期lag phase试验开始到降解率达到10的时期。27十天观察期10一d window生物降解率达到lo之后的lOd试验时间。28降解期degradation phase停滞期结束到降解率达到最大降解率的90的时期。3受试物信息a)分子式；】GBT 21802-2008b)水中溶解度；c)蒸气压；d)结构式；e)纯度；f)主要成分组成比例g)吸附性；h)微生物毒性。4方法概述41原理受试物溶
5、解或悬浮在试验培养基中，加入未经驯化的接种物，在黑暗、密闭、搅拌和25士1条件下培养28 d，用碱石灰吸收产生的二氧化碳，连续测定耗氧量。受试物生物降解时接种物消耗的氧量经平行试验空白对照校正后，以占ThOD的百分数表示降解率。另外，通过化学分析测定试验开始和结束时受试物浓度，可以确定受试物的初级生物降解性。通过DOC分析，可以确定受试物最终生物降解率。42参比物本标准推荐苯胺(新蒸馏)、醋酸钠或苯甲酸钠作为参比物。5试验准备51设备a) BOD测定仪或呼吸测定仪(配6个300 mL烧瓶和COz吸收杯多个)；b) 培养箱或水浴(25土1)；c)膜过滤器(可选)；d)有机碳分析仪(可选)。52接
6、种物从使用和排放各种化学物质的不少于lo个场所采集接种物，这些场所包括城市污水处理厂、工业污水处理厂、河流、湖泊和沿海。采集活性污泥、表层土壤、水等样品各1 L将它们混合在一起，去除漂浮物静置，以氢氧化钠或磷酸调节上清液pH值为71，曝气培养235 h后静置30 min，弃去上清液的三分之一并加入等体积的含葡萄糖、蛋白胨和磷酸钾各01的溶液(pH值为7)，再次曝气。培养过程每天操作1次。接种物中应出现原生动物，并且至少每3个月用参比物测定活性1次。接种物培养1个月后方可使用，但不能超过4个月。每3个月从10个场所采集接种物，并与正使用接种物等量混合，培养18 h24 h后方可作为新的试验接种物
7、。53试验用水使用高纯度去除毒性物质(如Cu”)的去离子水或蒸馏水，确保有机碳含量不得高于受试物浓度的10，每组系列试验使用一批水。54培养基541试验培养基贮备液用分析纯试剂制备下列贮备液：a)磷酸缓冲液：称取850 g磷酸二氢钾(KH。PO。)、2175 g磷酸氢二钾(K：HPO。)、4460 g十二水合磷酸氢二钠(Na：HPO；12H。O)和170 g氯化铵(NHtCl)，用水溶解，定容至1 L，pH值为72。b)氯化钙溶液：称取2750 g无水氯化钙(CaCI。)或3640 g二水合氯化钙(CaCI。2H。O)，用水溶解，定容至1 L。2GBT 21802-2008c)硫酸镁溶液；称取
8、2250 g七水合硫酸镁(MgSOt7Hz0)，用水溶解，定容至1 L。d)氯化铁溶液：称取025 g六水合氯化铁(FeCls6HzO)，用水溶解，定容至1 L。加入005 mL浓盐酸或04 gLEDTA二钠盐缓冲溶液保存。上述贮备液中如果出现沉淀，则需重新配制。542试验培养基的制备取磷酸缓冲液、氯化钙溶液、硫酸镁溶液、氯化铁溶液各3 mL，用试验用水溶解并定容至1 L。6试验程序61组别设计a)通常，试验中需要设置下列组别：瓶1：非生物降解对照组(含受试物和去离子水，质量浓度为100 mgL)；瓶2、瓶3、瓶4：含受试物、试验培养基和接种物的试验组(受试物质量浓度为100 mgL)；瓶5：
9、含参比物、试验培养基和接种物的程序对照组(参比物质量浓度为100 mgL)；瓶6：仅含接种物和试验培养基的空白对照组。b)必要时：含受试物、参比物和接种物的毒性对照组(见附录A)。62受试物贮备液受试物或参比物的水溶解度若超过1 gL，则称取1 g10 g，用试验用水溶解并定容至1 L。否则，将受试物直接加入试验培养基中，确保受试物溶液均质化。63试验操作难溶受试物试验中不能使用助溶剂和乳化剂，可采用研磨或超声分散等适当方式使溶液均质化。试验瓶2，瓶3和瓶4(试验组)，瓶5(程序对照)和瓶6(接种物的空白对照组)加入接种物质量浓度为30 mgL，瓶l中不加入接种物而作为非生物对照，CO：吸收杯
10、加入CO：吸收剂，装好设备，检查气密性，开始搅拌，在黑暗条件下开始测量氧消耗。每天检查温度和搅拌器状态，定期测定溶解氧浓度，并观察试验瓶中颜色变化。28 d试验结束时，测定各瓶试验溶液pH，测定瓶1中受试物浓度或代谢中间产物的浓度。如可能发生硝化作用，测定硝酸盐或(和)亚硝酸盐浓度。7质量保证与质量控制a)在稳定期、试验结束时或十天观察期结束时，平行试验间的降解率最大差别低于20；b)试验进行到7天和14天时，参比物降解率分别高于40和65；c) 接种物空白对照组的氧消耗量通常在20 mgL30 ragL(以Oz计)；28 d试验期间，氧消耗不高于60 ragL(以02计)；d)若pH值超出6
11、85，且受试物氧消耗量低于60，则设置较低的受试物浓度，重新试验。8数据与报告81数据处理一定时间后，受试物氧消耗量(mg)经同时刻段的接种物空白对照校正后除以受试物质量(mg)，得到用毫克氧每毫克受试物(mgmg)表示的BOD，见式(1)：BOD：771-772优3式中：m，受试物氧消耗，单位为毫克(mg)；m。空白对照氧消耗，单位为毫克(mg)；GBT 2 1 802-2008m。受试物加入量，单位为毫克(rag)。生物降解率可从式(2)中获得： D一器100式中：D生物降解率，。对于混合物，ThOD的计算可通过元素分析，将其当作单个化合物，根据硝化作用是否发生选取适当的ThOD(ThOD
12、NH|或ThODN。，)(见附录B)。当硝化作用发生但反应不完全时，可通过从硝酸盐和亚硝酸盐的浓度变化校正硝化作用的氧消耗。若瓶1中的受试物有减少，计算非生物降解率，用该瓶中28 d后受试物的浓度(S)去计算降解率，见式(3)：Do一薯鱼100式中：D。非生物降解率，；S。试验开始时瓶1中受试物浓度，单位为毫克每升(mgL)；S。试验结束时瓶1中受试物残留浓度，单位为毫克每升(mgL)。当采用DOC测定时(可选)，计算t时刻的最终生物降解率，见式(4)：B一，一舞舢。式中：D。一一时刻的降解率，；Co含受试物和接种物的试验组的初始DOC浓度，单位为毫克每升(mgL)；C：含受试物和接种物的试验
13、组t时刻的DOC浓度，单位为毫克每升(mgL)C-c。，空白对照组的初始DOC浓度，单位为毫克每升(mgL)；cb。，f时刻空白对照组的DOC浓度，单位为毫克每升(mgL)。当有无菌对照时，化学分析测定受试物母体化合物含量，见式(5)。D。一生号；盟100 Lj(0)式中：n非生物降解率，；c5。，瓶1受试物初始DOC浓度，单位为毫克每升(mgL)；C。，f时刻瓶1受试物DOC浓度，单位为毫克每升(mgL)。82结果报告a)受试物：物理属性，及基本理化性质；受试物鉴别数据。b)试验条件：接种物：状态和取样地点，浓度和预处理方式；污水中工业废水的比例和状况(若已知)；试验周期与温度；水中难溶受试
14、物溶液悬浮液制备方法；程序改变的原因及解释说明。c)结果：4GBT 21802-2008将数据填入“数据表”(见附录c)；任何观察到的抑制现象；任何观察到的非生物降解；化学物质分析数据(若适用)；受试物降解产物的分析数据(若适用)；受试物及参比物的降解曲线，包括停滞期、降解期、十天观察期和下降期稳定期、试验结束时和(或)十天观察期结束时的降解率。d)结果讨论。GBT 21802-2008附录A(资料性附录)受试物对接种物的生长抑制的处理当快速生物降解试验中受试物表现为无生物降解性时，为判别是源于受试物对接种物的抑制作用还是因为受试物的惰性，推荐采用以下措施：微生物毒性试验和生物降解试验采用类似
15、或相同的接种物。微生物毒性试验可以单独或联合采用以下方法：污泥呼吸速率抑制试验、BOD和(或)微生物生长抑制试验。生物降解性试验中，为避免受试物抑制接种物的活性，建议受试物浓度设置为ECs。的1lO(或低于EC：。)。若受试物对接种物EC；。大于300 mgL时，可判定受试物对接种物无抑制影响；当受试物对接种物EC；。低于20 mgL时，应设置较低的受试物浓度。推荐采用密闭瓶法试验或使用14C标记材料评价生物降解性；若采用经受试物驯化的接种物，试验时可设置较高的受试物浓度，但试验结果不能用于评价快速生物降解性。B1理论需氧量(ThOD)附录B(资料性附录)有关参数的计算和确定GBT 21802
16、-2008当元素组成确定或已知时，可以计算得出理论需氧量。对于化合物tH。cl。N。Na。0。Rs，通常基于形成铵盐的降解方式计算ThOD，其理论需氧量见式(B1)：ThOIx旷坐蔓竺!裟兰塑生型B， H一上兰而百厂生生 ( 1)如果预测到或可确定发生硝化作用时，就要基于形成硝酸盐的降解方式来计算ThODNo，其理论需氧量式(B2)：。B2，No，一i亓万一()式(B1)和式(B2)中ThOD理论需氧量，以每毫克化学品消耗的氧气量(mgmg)表示；c化合物分子中碳原子个数；化合物分子中氢原子个数；c卜一一化合物分子中氯原子个数；n一一化合物分子中氮原子个数；s化合物分子中硫原子个数；p化合物分
17、子中磷原子个数；nn化合物分子中钠原子个数；o化合物分子中氧原子个数；MW化合物相对分子质量。若硝化作用不完全但确已发生，则需通过测定硝酸盐和亚硝酸盐的浓度进行校正ThOD。B2溶解性有机碳(DOC)从试验容器中取出样品后立即用适当的过滤器和滤膜过滤，舍去最初的滤出液20 mL(当使用小过滤器时，此量可相应减少)，保留10 mL20 mL(取决于分析需要的体积)供有机碳分析，用有机碳分析仪测定DOC浓度，有机碳分析仪必须能够精确测量相当于或低于在试验所用的起始DOC浓度的10的量。在同一工作日内不能测定滤液样品时，可在冰箱中4下保存样品，但保存时间不得超过48 h，在一18可保存较长时间。注：
18、滤膜表面通常涂有亲水性涂层物质，这样，过滤器就可能含有溶解性有机碳，影响生物降解性的测定。将过滤器放人去离子水中煮沸3次、每次1 h，可去除涂层物质和溶解性有机物，其后过滤器可在去离子水中保存1周。如果使用一次性的过滤器，则每批都应检查确保其不释放出溶解性有机碳。同时确保受试物不被过滤器吸附。在离心力4 000 g(约为40 000ms2)下离心15min可代替过滤，由于不是全部的细菌都能去除，或者细菌体的部分有机碳会再溶解，该方法不适用于分析DOC初始浓度低于10mgL的样品。GBT 21802-2008c1实验室C2试验开始日期C3受试物附录c(资料性附录)改进的MITI试验(I)数据表名
19、称：受试物储备液的浓度：mgL以化学物质的质量计试验培养基的初始浓度，Co：mgL以化学物质的质量计进行试验的反应液体积：mLThOD：mgL(以02计)C4接种物污泥采样的地点：驯化后活性污泥的悬浮物浓度：mgL在每升最后介质中加入的污泥体积：mL在最后介质中污泥的浓度：mgLc5生物降解性的氧消耗量表C1氧消耗量测定结果时间d试验组的氧消耗mg：ala2a3空白对照组的氧消耗mg：6氧消耗修正值rag：al一6口2一ba3一bBOD(mgrng)。(口16)c0V(a26)Coy(a36)CoV8表C1(续)GBT 21802-2008时间d降解率(BODThODX00)123平均值注：参比物可使用类似的格式。8在重复试验中有相当大的差别时不要取平均值。C6碳分析(可选)表C2碳分析测定结果DOC烧瓶 DOC去除率 平均值测量值 修正值去离子水+受试物活性污泥+受试物 bl blc活性污泥+受试物 62 b2 c活性污泥+受试物 63 b3一c空白对照组C7特定化学物质分析D表C3受试物残留量测定结果试验结束时受试物的残留量 初级生物降解率去离子水非生物降解对照组 SbS。l含接种物的试验组 SdSdD。一学10。分别计算瓶al，a2，a3的初级降解率。c8 BOD与时间的曲线图如有BOD与时间的曲线图，应附上。
