1、ICS 11220B 41 园园中华人民共和国国家标准GBT 1 799972008代替GBT 179996一1999SPF鸡 微生物学监测第7部分：SPF鸡 胚敏感试验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 7：Embryo susceptibility test for SPF chicken2008-12-31发布 2009050 1实施丰瞀髅紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“刖 罱GBT 1799972008GBT 17999(SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SPF鸡微生物学监测总则；第2部分：SPF鸡红细胞凝集
2、抑制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；一第7部分：SPF鸡胚敏感试验；一第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分为GBT 17999的第7部分。本部分代替GBT 1799961999SPF鸡胚敏感试验。本部分与GBT 179996 1999相比主要变化如下：增加了资料性附录A“卵黄囊接种技术和EIDs。测定方法”；重新制定了试验成立条件和结果判定标准。本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本
3、部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星，朱果、单忠芳、姜骞，司昌德、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 1799961999。SPF鸡微生物学监测第7部分：SPF鸡胚敏感试验GBT 17999720081范围GBT 17999的本部分规定了胚敏感试验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行禽脑脊髓炎病毒抗体的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 17999的本部分的引用而成为本部分的条款
4、。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 179991 2008 SPF鸡微生物学监测第1部分：SPF鸡微生物学监测总则3原理Van Roekel(cVcc AV35)毒株是禽脑脊髓炎病毒的一株胚适应毒株，具有高度嗜神经性。对无抗体鸡群的鸡胚有致病性，引起肌肉营养不良、运动性降低、足趾卷曲等特征性病变。免疫或感染鸡群的鸡胚对经卵黄囊接种的病毒有抵抗力。4试剂和器材41试剂411 AEVan Roekel病毒(EID5。的测定参
5、见附录A)。412 SPF鸡蛋。413被检蛋(取样比例见GBT179991 2008)。42器材421 1 mL注射器。422 7号针头。423恒温培养箱。424超净工作台。425小型孵化器。5操作程序51取被检蛋、标准SPF蛋孵至6日龄。52取6日龄被检鸡胚，每胚经卵黄囊接种(接种方法参见附录A)02 mL含100 EID5。的AEVanRoekel病毒液，接种完毕用蜡封孔，同时设6日龄SPF鸡胚接种病毒与不接种病毒分别作为标准阳性、阴性对照。53接种后的鸡胚，置于37375孵化器中孵化，每天照胚一次，取出死亡鸡胚，接种后第12 d取出全部鸡胚待检。1GBT 1 7999720086结果判定
6、61阴性、阳性对照当接种SPF对照鸡胚均呈禽脑脊髓炎病毒所致的特异病变(早期为胸腹部肌肉皮下水肿，当接种后10 d12 d解剖活胚时，见腿肌萎缩、足趾卷曲)，不接种SPF对照鸡胚无特异病变时，试验成立。62被检结果判定100鸡胚有特征性病变，表明此鸡群未感染禽脑脊髓炎病毒；鸡胚无特征性病变，表明此鸡群已感染禽脑脊髓炎病毒。附录A(资料性附录)卵黄囊接种技术和EID。测定方法GBT 1799972008A1 卵黄囊(Ys)接种选5日龄7日龄鸡胚经照蛋检查后，画出气室和胎位，对应气室中央的蛋壳先用25Voo碘酒消毒，再用75酒精脱碘。用打孔器打一小孔，勿损伤壳膜。接种时针头迅速稳定地通过小孔，沿胚
7、的纵轴深入约3 cm，此时注射器轻轻往回抽一下，如针头在卵黄囊中，可见卵黄被抽出，此时就可将注射物注人，用融化的石蜡封闭壳孔，置37培养。A2 EID50的测定A21 将AE-Van Roekel病毒悬液作10倍系列稀释，取适宜稀释度的病毒02 mL接种6日龄SPF鸡胚，由最高稀释度开始，每一稀释度接种4枚6枚。接种后的鸡胚，置37375孵化器中孵化，每天照蛋一次，取出死亡鸡胚，至接种后第12 d，统计鸡胚的死亡和感染数量。A22对于接种后24 h内死亡的鸡胚忽略不计。与正常SPF鸡胚对比，感染AEVan Roekel病毒的鸡胚出现特征性病变(早期为胸腹部肌肉皮下水肿，晚期表现为腿肌萎缩、足趾
8、卷曲)的判为感染。A23计算各稀释度接种鸡胚后死亡及感染个体的百分率。按Reed和Muench法计算病毒胚半数感染量(EIDso)。A24试验举例：病毒稀释及鸡胚死亡情况见表A1。表A1观察结果 累计结果病毒稀释度感染及死亡数 未感染数 百分率 感染及死亡数 未感染数 百分率lo 4 6 0 100 13 O 100lo 5 5 1 83 7 1 8810 6 2 4 33 2 5 2910 7 0 6 O O 11 O距离比例一嚣糍一o64LgEID；。一高于50的病毒稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数一一5+064(一1)一一564则：EID5010_5“o2 mL。即：将病毒悬液作10_5 64稀释后，接种鸡胚02 mL，可以造成50的鸡胚感染。将病毒悬液作103 64稀释后，即为100EID5。o2 mL。
