1、GBT 1470193 1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B2的测定。待测液中维生素 B2检测浓度为0.050.2 gmL。 2 引用标准 GB 6682 实验室用水规格 3 方法原理 维生素B2（即核黄素C17H20N1O6）在440nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内 其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光 强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。 4 试剂和溶液 除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。 4.
2、1 盐酸溶液，0.1molL：将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。 4.2 盐酸溶液，1molL。 4.3 氢氧化钠（GB 629）溶液，1molL。 4.4 冰乙酸（GB 676）。 4.5 冰乙酸溶液，0.02molL：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。 4.6 高锰酸钾（GB 643）溶液，40gL。 4.7 过氧化氢（HG 31082）溶液，100mLL。现用现配。 4.8 核酸素标准溶液 4.8.1 核黄素贮备液：核黄素（中国药典参照标准），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02molL乙酸溶液（4.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直
3、至溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温（4）保存。 该溶液每毫升含0.1mg核黄素。 4.8.2 核黄素贮备液：取核黄素贮备液（4.8.1）10mL用0.02molL乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4）保存。 页码，1/3GB/T 14701932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147010a.htm 该溶液每毫升中含10 g核黄素。 4.8.3 核黄素标准工作液：取核黄素贮备液（4.8. 2） 10mL，用水稀释至 100mL。现用现配。 该溶液每毫升中含1 g核黄素。 4.9 荧光素标准溶液 4.9
4、.1 荧光素贮备液：称取荧光素（QHG 22786）0.0500g，用水稀释至1000mL，盛于棕色瓶中，低温（4）保存。 该溶液每毫升中含50 g荧光素。 4.9.2 荧光素标准工作液：取荧光素贮备液（4.9.1）1mL，用水定容至1000mL，盛入棕色瓶中，低温保存。 该溶液每毫升中含0.05 g荧光素。 4.10 溴钾酚绿pH指示剂：取溴钾酚绿（HGB 3386）0.1g，加氢氧化钠溶液（0.05molL）2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL。变色范围ph4.65.2。 4.11 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（QHG 2001），防止吸潮。5 仪器、设备 5.1 荧光分光光度计。
5、 5.2 分析天平：感量0.0001g。 5.3 电热恒温水浴。 5.4 具塞玻璃刻度试管，15mL。 6 试样的制备 采集具有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。 7 分析步骤 7.1 称样：单一饲料、配合饲料、浓缩饲料称取12g，精确至0.001g。维生素预混料称取0.250.50g，精确至0.0001g，将试样置于100mL容量瓶中。 7.2 样液的制备：向盛样品的容量瓶中加65mL盐酸溶液（4.1），于沸水浴中加热30min，开始加热510min时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于12112315 磅高压釜中
6、加热30min。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液（4.3）调节pH至6.06.5，然后立即加稀盐酸溶液（4.2）使pH值约为4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿色）。用水稀释至刻度。 通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初510mL溶液，收集滤液于100mL 锥形瓶中。取整份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释到测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为0.1页码，2/3GB/T 14701932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147010a.htmgmL（以下操作避免紫外光照射）。 7.
7、3 杂质氧化：于a、b、c三支15mL刻度试管（5.4）中各吸入样液（7.2）10mL，同时做平行，向试管a、b、c中各加入1mL蒸馏水，向试管b中加入1mL核黄素工作液（4.8.3）。然后各加入冰乙酸（4.4）1mL，旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液（4.6）0.5mL，旋摇混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢溶液（4.7）0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。 7.4 测定：用荧光素溶液（4.9.2）调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440nm，发射波长525nm，测定试管a、b的荥光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过
8、10s。在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定卒荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。 8 分析结果的计算和表述 8.1 计算方法和公式 核黄素（维生素B2）含量以mgkg（或gkg）表示，按下式计算：A-CB-A值应在0.661.5，否则需调整样液的浓度。 8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。 9 重复性 同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值： 在核黄素含量小于或等于5.0mgkg时，不得超过平均值的15。 在核黄素含量大于5.0mgkg时，不得超过平均值的10。 在核黄素含量大于50mgkg时不得超过平均值的5。 核黄素（ VB2mgkg）（ AC ）（ B A）（ M m）（ V V1） R 式中： A 试管a（样液加水）的荧光强度；B 试管b（样液加标样）的荧光强度；z 试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度；m 加入核黄素标样的量， g；V 样液的初始体积，mL；V1测定时分取样液的体积，mL；m 试样质量，g。R 稀释倍数。页码，3/3GB/T 14701932006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbB147010a.htm
