1、版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1905-2007 牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction for bovine viral diarrhea/mucosal disease 2007-05-23发布2007-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售目。吕本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 1905-200
2、7 本标准起草单位:中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本标准主要起草人:王伟利、王振国、刘金华、孟日增、肖成疏、石建平、牟峻、逢奎春、杨伟、赖少梅。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售1 范围牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒反转录聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。2 规范性引用文件SN/T 1905-2007 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准
3、，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和民验方法3 原理根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5端非编码区最保守的核昔酸序列，设计合成一对特异性引物，利用反转录聚合酶链式反应技术分别采用一步法和两步法从各种样品中扩增牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的特异性片段，该片段既可用于病毒性腹泻/粘膜病病毒基因分型又可以区别于其他瘟病毒属成员。4 设备和试剂4.1 主要仪器和设备4. 1. 1 PCR扩增仪。4.1.2 低温高速离心机、微量高速离心机。4.1.3 电泳仪、电泳槽。4.1.4 凝胶成像
4、分析系统。4.1.5 冰箱。4.1.6 超净工作台。4.1.7 组织匀浆器。4.1.8 二氧化碳培养箱。4.2 试剂和耗材4.2.1 水:所用水应符合GB/T6682中三级水(三蒸水)的规格。用于PCR(尤其核酸提取)的水要用DEPC处理以除掉RNA酶，配制方法见第人1章。4.2.2 营养液:配制方法见第A.2章。4.2.3 维持液:配制方法见第A.3章。4.2.4 细胞分散液:配制方法见第A.4章。4.2.5 化学试剂:所有的化学试剂均为分析纯。Catrimox-14(Cat-14)、硫氨酸肌、酷、三氯甲皖、拧棱酸纳、正丁醇、乙酸纳、乙醇、异丙醇(-20C预冷)。4.2.6 其他i式剂:RT
5、-PCR Beads(反转录酶)或AMV反转录酶(5U/，uL)、T叫DNA聚合酶(5U/ L)、dNTPs(每种浓度均为10mmol/L)、RNasin(40U/L)、MgC12(15 mmol/L)、琼脂糖(电泳级)、版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1905-2007 DNA Marker DL2000 4.2. 7 50 X Tris冰乙酸(TAE)电泳缓冲液:配制方法见第A.5章。4.2.8 10 mg/mL漠化乙链榕液:配制方法见第A.6章。4.2.9 1%琼脂糖凝胶:配制方法见第A.7章。4.2. 10 引物:根据病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)国际标准株基因序列，在
6、其最保守的5端非编码区序列设计合成一对特异性引物:5 -AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3 , 5 -TCTGCAGCAC CCT A TCAGG-3配制成20mol/L，-20C保存。4.2.11 可调微量移液器(20L1000L、20L200L、2L20L、O.5L10L)。4.2.12 1. 5 mL、0.2mL离心管和吸头(用DEPC水处理后高压灭菌备用，处理方法见第A.8章)4.3 标准毒株和细胞4.3. 1 标准毒株:以BVDV国际标准毒株NADL株或OregonC24 V株为民验的参照病毒株。4.3.2 细胞:按常规方法取健康新生棋牛辜丸，制备原代辜丸细胞。5 阳性对照
7、样品和阴性对照样品5.1 阳性对照样品由指定单位提供或按下列方法制备:将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按10%接种原代旱丸细胞，于37C吸附1h后加入维持液，37C培养，待CPE达到70%时收获病毒悬液:冻融2次3次，5000 r/mi口离心10min，取上清液备用。5.2 阴性对照样品由指定单位提供或按下列方法制备:将生长良好的原代旱丸细胞，冻融2次3次，5000 r/mi口离心10min，取上清液备用。6 试验方法6.1 样品的处理6.1.1 组织样品:包括从肠粘膜刮取的物质、肾、肝、肺、淋巳结、脾、胸腺。取2g5 g组织样品切成小块，加5mL15 mL预冷的Hanks平衡盐溶液匀浆2mi
8、n，制成悬液，4C5 000 r/min离心10mi口，取150L上清液加入1mL Ca1-14振荡?昆匀。6.1.2 液体样品:包括血清、血液(加拧棱酸盐、EDTA、肝素等人各种拭子(鼻腔、气管和眼)、精液。6.1.2.1 含EDTA的血液:取50L加到装有1mL 1XSSC(见第A.9章)榕液的离心管中，混匀，4C 12 000 r/mi口，离心1min，倒掉上清液，将沉淀物重新悬浮于残留液中，加入500LCat-14振荡泪匀。6.1.2.2 含拧模酸铀或肝素的血液:取50L加入500LCat-14振荡?昆匀。6. 1. 2. 3 血清、精液、各种拭子悬液等液体样品:取100L，加入500
9、LCat-14振荡?昆匀。6.1.3 阴性和阳性对照样品:分别取100L，加入500LCat-14振荡?昆匀。6.2 RNA的提取上述各种处理样品立即振荡30s，室温放置10min30 mi口，样品4C12 000 r/mi口，离心5min，倒置于吸水纸上，沾干液体，瞬时离心5s，用带滤芯的吸头吸干残留液体，将沉淀溶于200LGlTC(见第A.10章)缓冲液里，间歇振荡5min，置于冰上。上述悬浮液用100L水饱和酷和100L预冷的含2%正丁醇的三氯甲:皖进行抽提，振荡30s , 4C 12 000 r/mi口，离心5min;取上清液;加入100L预冷(-20C)的含2%正丁醇的三氯甲:院振荡
10、30s , 4C 12 000 r/mi口，离心5min，取上清液。上清液加入300L异丙醇，-70C冻存0.5h，或者20C至少1h(过夜或更长时间)。取出后4C12 000 r/min，离心5mi口，用500L80%乙晖漂洗，再用500L100%预冷(-20C)2 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1905-2007 的乙醇漂洗。真空干燥，室温下加入50LDEPC水，溶解管壁上的RNA，轻轻混匀，2000 r/min离心5 So冰上保存备用，若放置一70C可长期保存。6.3 PCR 1ftl曾6.3. 1 检测方法1:一步法(固体反转录酶)6.3. 1. 1 反应体系25L:取出
11、TqDNA聚合酶、RT-PCRBeads(固体酶颗粒)、引物1、引物2和制备的RNAo在已编好号的0.2mL的PCR反应管中，按表1进行反应液的配比，由匀后瞬离。表1成分用量RT-PCR Beads 1/2粒引物1(20mol/L)0.5L 引物2(20mol/L)0.5L I泣qDNA聚合酶(5U/L) O. 25L RfA 10L DElC ddH, () 13.75L 6. 3. 1. 2 扩增程序及反应条件:420C30 min;92C 3 mi川920C15 s ,58C 30 s , 72C 1 min，40个循环;72C 10 min;最后4C保温。6.3.2 检测方法2:一步法
12、(液体反转录酶)6.3.2. 1 反应体系25L:5 X Buffer 5L、dNTP(各2.5mmol/L)2L、MgC12(15 mmol/L) 2. 5L、AMV反转录酶(5U/fLL) 2L、1叫酶(5U/fLL) O. 125L、上游引物和下游引物(20mol/L)各O. 5L、RJA4L、ddH208. 375L，由匀后瞬离。6.3.2.2 扩增程序及反应条件:42C30 mi川95C3 min;90C 30 s , 58C 15 s , 72C 30 s，35个循环;720C 10 min;最后4C保温。6.3.3 检测方法3:二步法(液体反转录酶)6.3.3.1 RT(反转录)
13、:反应体系20L:AMVRT 5XBuffer 4L、dJTP(2.5mmol/L)2. 5L、RJasin( 40 U / fL L) 1L、反转录酶(5U/ fLL) 1L、上游引物或下游引物(20mol/L)1L、模板RNA5L、ddH20 5.5L，由匀后瞬离。6.3.3.2 扩增程序及反应条件:42C水浴60min，990C煮沸5mino 6.3.3.3 PCR扩增:反应体系为25L:模板cDJA1L、T叫酶(5U/L) O. 125L、dJTP(2. 5 mmol/L) 1L、上游引物和下游引物(20mol/L)各O.5L、10X Buffer(含Mg2+)2.5L、ddH2019
14、.375L，泪匀后瞬离。6.3.3.4 扩增程序及反应条件:94C5 mi川94C30 s; 58C 40 s; 72C 1 mi口，35个循环;72C 5 mi川最后4C保温。7 PCR产物的电泳检测用TAE电泳缓冲液(见附录A)配制成1%琼脂糖平板(澳化乙链终浓度O.5g/mL) 0将平板放入水平电泳槽中，加入1XTAE电泳缓冲液至刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6L与6L上样缓冲液混合，分别加入样品孔中，取5LDJA Marker DL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/cm 恒压电泳30min45 mino 8 结果判定8.1 用凝胶成像系统进行分析。3 版权所有 禁止翻制、电子
15、传阅、发售SN/T 1905-2007 8.2 阴性样品元条带，阳性样品有一条带，大小为244忡，在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，大小与阳性样品相同为244忡，即可判定为阳性。必要时取PCR扩增产物进行测序，如果结果与附录B参考序列比较，序列相似性在95%以上，可进一步确认待测样品结果为阳性。8.3 如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次民验都为非特异性反应时，可判为阴性。4 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1905-2007 附录A(规范性附录)水、细胞培养液及试剂配置A. 1 DEPC-ddH20焦碳酸二乙醋
16、(DEPC)处理的双蒸水1 000 mL双蒸馆水加1mL DEPC，室温放置24h以上，0.105MPa蒸汽高压30min, 4 C或室温保存。A.2 营养液DMEM培养基加10%元BVD抗体棋牛血洁、内含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL，抽滤除菌。A.3 维持液DMEM培养基内含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL，抽滤除菌。A.4 细胞分散液膜酶乙二肢四乙酸二铀(EDTA)无钙镜PBS抽滤除菌，4C保存备用。A. 5 50 X Trs-J乙酸(TAE)电泳缓冲液Tris 冰乙酸0.5 mol/L EDTA(pH8. 0) 三蒸水定容至高压灭菌，备用。A.6 10 m
17、g/mL 臭化乙徒溶液2.50 g 0.20 g 1 000 mL 242. 0 g 57.1 g 100 mL 1 000 mL 三蒸水100 mL 澳化乙链1 g 置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝宿包裹容器保存于室温。A.7 1%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖TAE电泳缓冲液(50倍)灭菌三蒸水1 g 2 mL 98 mL 微波炉中完全融化，加漠化乙链(EB)榕液5L，A.8 离心管、吸头处理方法离心管、吸头应放在0.1%DEPC水中浸泡24h以上，取出烘干DEPC水后再0.105MPa蒸汽高版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1905-2007 压30min，晾干后使
18、用。A.9 1 XSSC溶液0.15mol/L氧化铀(NaCl)、15mmol/L拧棱酸铀、pH70A.10 GITC缓冲液4 mol/L异硫氨酸肌、0.2mol/L乙酸纳(pH4)、0.1mol/L 2辈革基乙醇。6 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售SN/T 1905-2007 附录B(资料性附录)BVDV扩增产物的序列160 AGGCTAGCCA TGCCCTTAGT AGGACTAGCA TAATGAGGGG GGTAGCAACA GTGGTGAGTT 61120 CGTTGGATGG CTTAAGCCCT GAGTACAGGG TAGTCGTCAG TGGTTCGACG CCTTGG
19、AATA 121180 AAGGTCTCGA GATGCCACGT GGACGAGGGC ATGCCCAAAG CACATCTTAA CCTGAGCGGG 181240 GGTCGCCCAG GTAAAAGCAG TTTTAACCGA CTGTTACGAA TACAGCCTGA TAGGGTGCTG 241244 CAGA 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售khCON-mo-问Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程SN/T 1905-2007 -兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当咛开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数12千字2007年9月第一版2007年9月第一次印刷印数1-2000 定价8.00元-兴书号:155066.2-18049 SN/T 1905-2007
