1、GB 17 0 0 9 1 997 前言风苦苦是由归l磨病毒引起的急性呼吸道传染病，呈世界性分布.在我国归属于法定丙类传染病.二年四季均可发生，以冬春季发病为多，易感年龄以)-5岁为多，故流行多见于学龄前儿童。自风移疫苗问世以来，发病率明显下降。风掺临床症状轻微，但孕妇娃振早期初次感染风莎病毒后，病毒可通过血胎屏障进入胎儿，常叮造成先天性胎儿畸形、死胎、早产.因此，风磅的早期确诊及预防极为重要。牛二标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准由浙江医科大学传染病研究所、中国预防医学科学院病毒学研究所负责起草。本标准主要起草人:刘克洲、张礼璧。本标准由卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院负责解释。
2、1. :; 1 范围中华人民共和国国家标准风童基诊断标准及处理原则Diagnostic criteria and principles 。rmanagement r or rubell a 本标准规定了风瘦的诊断标准及处理原则。GB 17 0 0 9 - 1 9 9 7 本标准适用于各级各类医疗、保健机构、卫生防疫机构和人员对风彦病人的诊断、报告和处理。2 诊断原则典型病例可根据临床表现结合流行病学作出临床诊断，不典型病例需根据血清风磅抗体的检测或风彦病毒的分离阳性予以确诊。3 诊断标准3. 1 风彦3. 1. 1 流行病学史与确诊的风殇患者在1421天内有接触史。3. 1. 2 临床症状3.
3、1.2.1 发热。3.1.2.2 全身皮肤在起病12天内出现红色斑丘彦。3. 1. 2.3 耳后、枕后、颈部淋巴结肿大或结膜炎或伴有关节痛(或关节炎。3. 1. 3 实验室诊断3. 1. 3. 1 咽拭子标本分离到风掺病毒(见附录A).或检测到风殇病毒核酸。3. 1. 3. 2 1个月内未接种过风彦减毒活疫苗而在血清中查到风彦IgM抗体(见附录)。3. 1. 3. 3 恢复期病人血清风殇IgG抗体滴度较急性期有4倍或4倍以上升高，或急性期抗体阴性而恢复期抗体阳转(见附录B)。3. 1.4 病例分类3.1.4.1 疑似病例:具备3.1.2.2条，同时伴3.1.2.1或3.1.2.3条。3.1.4
4、.2 临床诊断病例:疑似病例加3.1. 1条。3.1. 4.3 确诊病例z疑似病例加3.1.3.1或3.1.3.2或3.1.3.3条。3. 2 先天性风殇综合征3. 2. 1 临床表现3. 2. 1. 1 新生儿自内障/先天性青光眼，先天性心脏病，听力缺损，色素性视网膜病，唇裂膊裂，头小畸形.X线骨质异常。3. 2. 1. 2 紫癫、脾肿大、黄症、精神性迟缓、脑膜脑炎。3. 2. 2 经实验室确诊患儿母亲在娃振早期有风殇病毒感染史国家技术监督局1997-10-06批准1998-10-01实施131 GB 1 7009 - 1 997 3.2.3 实验室诊断3. 2. 3. 1 婴儿血清风殇Ig
5、M抗体阳性。3.2. 3. 2 婴儿风彦IgG抗体水平持续存在，并超过母体被动获得的抗体水平(4倍以上)。3.2. 3.3 婴儿咽拭子、血、尿、脑脊液或脏器活检标本分离到风彦病毒或检测到风莎病毒RNAo3.2.4 病例分类3.2.4.1 疑似病例=具备3.2.1.1任一条或可伴3.2.1.2任一条。3.2.4.2 临床诊断病例:具备3.2.1.1任一条或可伴3.2. 1. 2任一条.同时伴3.2.2条。3. 2.4.3 确诊病例:临床诊断病例加3.2.3.1或3.2.3.2或3.2.3.3条。4 处理原则4. 1 病人的隔离与治疗发现风殇疑似或诊断病例，应立即隔离，一般隔离至出参后5天回一般接
6、触者不进行检疫。对病人进行对症处理和支持治疗。先天性风莎综合征患儿根据病症专科治疗。确诊有风殇病毒感染的早期孕妇，为防止可能产生胎儿先天性畸形，建议及时终止娃振。4.2 预防孕妇风彦对育龄妇女，宜进行婚前或孕前检查血风影IgG抗体，如证实为易感者，均应接种风掺疫苗。孕妇娃振早期(3个月内)尽量避免同风彦病人接触。如一旦接触，可在潜伏期内查血清风莎IgG抗体，若阳性表明既往曾有过风磅病毒感染，若阴性应继续在接触后1个月左右再测一次血清IgG和IgM抗体，若明确阳转可判为风殇病毒感染。4.3 免疫预防预防风掺有效方法是接种风莎减毒活疫苗，可对易感人群实行接种。.-13 :1 A1 病毒分离从病人呼
7、吸道采集标本分离病原体。A 1. 1 标本收集GB 17009一1997附录A(标准的附录)病原学诊断方法j巩磅病人宜在出珍前4-.5天至殇后12天取咽拭予标本。先天性风珍综合征患儿除咽拭子标本外，亦可于出生后尽快取尿液、眼泪、脑脊液、骨髓等标本。将灭菌棉棒稍蘸液体(2%牛血清Eagle液) 反复涂抹患者咽部数次，然后将棉棒浸于上述标本液(l5mU中反复挤压.标本液中加足量抗生素(青、链霉素1000 u/mU及制霉菌素50g/mL(或工性霉素5周/mL)，A 1.2 接种取O.10. 2 mL标本液接种于生长在试管中的单层原代乳兔肾细胞(PRK)(或其他原代细胞如原代人111;肾、兔r纤维细胞
8、、人胚二倍体细胞等)上，置37C吸附12h后弃液，再加入含双倍常规抗生素量的维持液1mL，置33C培养，每隔4天换液，连续观察814夭。如无细胞病变可见，即置30C冻化3次.盲目传代。每次传代可接种于RK13、Vero、BHK、LLC-MK，细胞上，连续盲传3代。A 1.3 观察细胞病变年般于10天左右出现细胞病变。若不出现病变，可在接种14天后用100TCID50的ECH011病毒或定量的Sindb队或VSV、或脊髓灰质炎病毒攻击，并设正常细胞种毒对照。若对照出现病变，接种标本管无病变，表示原接种的细胞内己有病毒感染的存在。A1.4 毒株鉴定用已知风磅病毒免疫血清，观察能否与新毒株起作用.传
9、统用中和试验、血凝抑制试验或采用免疫荧光法作病毒鉴定等。A2 病毒核酸检测利用分子杂交技术或PCR技术检测风莎病毒核酸。B1 血凝抑制试验B1. 1 原理附录B(标准的附录)血清学诊断方法鹅红细胞(或鸽红细胞)上有风掺病毒受体，遇风殇病毒可产生凝集现象。若将抗体与病毒(血凝素)预先温育后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制。定量血凝素与不同稀释度抗体(血清)作用后能完全抑制血凝的最高血清稀释度，即为血凝抑制抗体效价。时.2王要材料B1. 2. 1 血凝板，6X 12或8X12个圆形孔(孔底光滑)的U形板。B1. 2. 2 定量移液器定量移液器选用25L(P0.025 mL)。B1. 2. 3
10、 尖底小试管:形如离心管，便于血清的吸取。B 1. 3 风廖血凝素的制备取毒种感染BHK细胞或Vero细胞，常规换液培养。末次换入2%牛血情199综合培养基，世33(GB 1 7009 -1 997 培养67天以上.t寺细胞病变十+十日才收获，冻化，取主清液用Tween-80乙酷处理即为血凝素才日用臼陶土处理的2%牛血清配制感染细胞的培养基来制备血凝素，贝IJ不用Tween-80乙酷处理。B1.4 血凝滴度所用溶液一律置4C预冷，微量塑料板法。血凝素用葡萄糖明胶巴比妥缓冲液以1: 2倍比递增稀释，再加0.25%新鲜鹅红细胞(或鸽红细胞)悬液，混匀，置4C至少1h.观察结果，以十十十十(4单f立
11、)的最高稀释度为血凝滴度。81.5 血凝抑制试验原血清O.1时_+0.7mL氯化镇肝素液.4C作用20mn后在1: 8稀释的血清中加1商积压鹅红细胞(或鸽红细胞) 1 h内摇23次，置4C过夜，再以2000 r/min的速度离心10min，取上清液待检。待检血清用pH6.2的葡萄糖明胶巴比妥缓冲液倍比稀释后，每子L加0.025时，血凝素(含4单位;如系pH9的血凝素，事先应用O.1 mol/L盐酸调至pH6.2左右再用)。抗原抗体在4(作用1h后加入0.25%鹅红细胞l滴(0.025mL).在4C下作用2h后判定结果，以完全抑制血凝为终点。每次试验预设以下对照:阳性血清对照:应出现一定已知效价
12、阴性血清对照应出现阴性结果待检血清对照:应无非特异性凝集抗*对照.应出现+十+十(4单位)、+十+(2单位)、十十-+0单位)、:l:(l /2单位)的凝集现象血球对照2应为阳性HI抗体阳性标准判定以1: 16作为阳性标准。葡萄糖-明胶-巳比妥缓冲剂(以;V)配制.巴比妥O. 58g 巴比妥纳O.38g 明胶O. 6日无水CaCI，O. 02g MgSO,. H,O O. 12g NaCl 8.5g 葡萄糖10g 巴比妥与明胶可分别先各在250mL蒸饱水中加温熔解，然后依次加入其他药品，溶解后加双蒸水至1000 mL.分装10瓶消毒。用前以O.1 mol/L盐酸将pH调至6.2.用于稀释待测血
13、清、配制血凝索及红细胞。氯f七锐肝素液配制MnCI, 3.96g 肝素16万单位加双蒸水至100mL.使用时以双蒸水稀释41音o: 3)。B2 酶联免疫吸附法检测风fl，iIgG抗体(ELISA间接法)B2.1 原理将风莎抗原包被子固相载体上，加上待检血清，再用酶标抗抗体间接检出特异性抗体。B2.2 材料B2. 2. 1 聚苯乙烯酶标板。B2. 2. 2 风彦阴性和阳性血清。B2.2.3 风殇抗原。、，, GB 1 700 9 1 997 B2. 2. 4 抗入!gG辣根过氧化物酶结合物。B2. 2. 5酶底物邻苯二胶双氧水。B2.3 操作程序B2. 3. 1 用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释风掺
14、抗原与未感染风殇病毒的细胞抗原(对照抗原)。B2. 3. 2 于40孔聚苯乙烯板的单排孔与双排孔分别加入0.1mL/孔的风殇抗原与对照抗原。有下最后一孔不加任何抗原作为空白对照.4C过夜。B2. 3. 3 以0.05%Tween衍生理盐水(NS-T)洗板三次，倒去洗液。B2. 3.4 在血凝板中以2%牛血清NS-T将待测血清稀释成1: 20-1 : 1 280四个稀释度.每个稀释度加风廖抗原与对照抗原各l孔(0.1mL.下同).轻轻振摇后置3TCl-2h。B2. 3. 5 以NS-T洗兰次，倒去洗液后每孔加入以2%牛血清NS-T稀释的抗人!gG辣根过氧化物酶结合物0.1mL(空臼对照不加).置
15、3TC1-2 h。B2. 3. 6 以NS-T洗三次，倒去洗液后加邻苯二胶-双氧水底物液，每孔O.1 mL(包括空臼对照孔).避光在3TC放置10-20min.随时观察，待对照孔开始显淡黄色时即用2mol/L硫酸终止，每孔加50L。B2. 3. 7 用空白对照孔调零点，以酶标仪(492nm)测定各于LOO值。00值不足O.05者按O.05计。凡同一稀释度下风殇抗原孔00值/对照抗原孔00值2.1即P!N为阳性.阳性之最高稀释度的倒数即为该血清的抗体效价。小于1: 20者视为阴性。B2. 3. 8 每次实验应作己知效价的阳性及阴性血清对照。的酶联免疫吸附法检测风lfIgM抗体(抗体捕捉ELISA
16、法)B3. 1 原理利用包被在固相载体上的抗人!gM链抗体，捕捉待检血清中的!gM.再用风掺病毒抗原和已知的酶标风殇病毒抗体去检测血清中!gM是否为抗风莎抗体。利用底物使酶显色而测知。B3. 2 材料B3. 2. 1 聚苯乙烯40孔或96孔板。B3. 2. 2抗人IgM链抗体。B3. 2. 3 风修病毒抗原和正常对照抗原。B3. 2. 4 抗风掺病毒抗体(单克隆或多克隆)。B3. 2. 5 酶标抗抗体z抗风彦病毒抗体和酶标抗抗体也可用酶标抗风莎病毒抗体代替。B3. 2. 6 酶底物邻苯二胶及双氧水。B3. 2. 7 已知的风殇!gM抗体阳性和阴性血清。B3. 2. 8 包被液:0.05mol/
17、L碳酸盐缓冲液(pH9.6)无水碳酸纳159 mg 碳酸氢纳293 mg.使用不超过2周蒸馆水加至100mL B3. 2. 9 洗涤液(NS-T):0.85%盐水的吐温液氯f七纳17 g 吐温20蒸馆水1. 0 mL 加至2000mL B3. 2.10 稀释液为5%牛血清的NS-T液。B3. 2.11 邻苯二胶一过氧化氢底物液先配拧橡酸磷酸缓冲液(pH5.0): 磷酸氢二纳18. 41 g 拧橡酸5. 1 g :; :l S GB 1 7009 -1 997 蒸馆水加至1000mL.分小瓶冰冻保存1脑用时配底物液z邻苯二胶(OPD)4mg 拧橡酸磷酸缓冲液10mL 30%双氧水5 mL B3.
18、3操作B3. 3. 1 包被抗人IgM链抗体，每孔100L.B3. 3. 2 4 C过夜，倒掉液体，用10%牛血清NS-T液120L封闭。B3. 3. 3 37CI h后倒去封闭液，洗三次。B3. 3. 4 加待现l血清(1, 100稀释，即1L待测血清加100L稀释液).每孔100L。每份血清加2孔或4孔)，3TC2h后洗三次。B3. 3. 5 加风殇抗原于1孔(或2孔)中，每孔100L;另l孔(或2于Ll中加正常对照抗原.4C过夜后，洗三次。B3. 3. 6 加风彦单克隆抗体每孔100L.3TCl.5 h后倒去抗体，洗兰次。B3.3.7 加酶标记的抗鼠抗体，每孔100L.37Cl. 5 h
19、后ffiJ去抗鼠抗体，洗4次，扣干。B3.3.6与B3.3. 7两步，亦可用加酶标抗风莎单克隆(或多克隆)抗体一步所取代，每孔加100L.37 C水浴2h，洗三次再扣干。B3. 3. 8 加底物邻苯二胶双氧水，每孔100L，370C1020minoB3. 3. 9 加终止酶的反应液即2mol/L硫酸.50L/孔，判定结果。B3. 4 结果的判定B3. 4. 1 肉眼判定法:待检血清与风掺抗原孔呈明显的棕色反应，正常对照抗原孔不(或微)显色，两者能用肉E昆明显察觉者即为限性。B3. 4. 2 用酶标仪的492nm光源测00值，血清的PIN二三2.1时为阳性(P为待测血清与风惨抗原作用的00值，N为待测血清与正常对照抗原作用的00值)。在用待测血清与己知风殇阴性血清对比时，贝IJP为待测血清与风莎抗原作用后的00值.N为标本阴性血清与风殇抗原作用后00值。Zit)
